Jak2基因兩個(gè)新的截短型轉(zhuǎn)錄本的鑒定.pdf

1、目的：
　　Jak2激酶（Janus kinase）屬于非受體酪氨酸激酶，通過(guò)各種受體（如：紅細(xì)胞生成素受體）介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要的作用。Jak2基因突變?nèi)纾篔ak2 V617F，Jak2 exon12與骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms， MPN）的發(fā)生密切相關(guān)。為了篩查是否還有其它突變位點(diǎn)，我們選取部分MPN確診病例（Jak2 V617F，Jak2 exon12突

2、變均為陰性）進(jìn)行Jak2基因cDNA全長(zhǎng)測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有新的轉(zhuǎn)錄本存在。本研究旨在證實(shí)新轉(zhuǎn)錄本的真實(shí)存在，鑒定其RNA結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)，同時(shí)分析其在MPN、AL、CML、健康人及其他物種中的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1.兩個(gè)新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)與鑒定
　　用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，為了消除非特異擴(kuò)增，針對(duì)Jak2b和Jak2c的序列在Jak2基因不同位置設(shè)計(jì)兩對(duì)引物F1/R1和F2/R2，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聯(lián)合測(cè)

3、序鑒定兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本存在；用oligo(dT)引物鑒定這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本是否是帶有Ploy A尾的成熟mRNA。
　　2.兩個(gè)新轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)測(cè)序分析，對(duì)目的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，擴(kuò)增Jak2基因CDS序列，測(cè)序鑒定。
　　3.用RT-PCR鑒定兩個(gè)新轉(zhuǎn)錄本在不同物種中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.用隨機(jī)引物和引物F1/R1和F2/R2進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，聯(lián)合電泳并測(cè)序分析，結(jié)果顯示兩種新轉(zhuǎn)錄本Jak

4、2b和Jak2c是真實(shí)存在的；用oligo(dT)引物和引物F1/R1和F2/R2進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，同樣聯(lián)合電泳并測(cè)序分析，結(jié)果顯示兩種新轉(zhuǎn)錄本Jak2b和Jak2c是成熟的mRNA；在正常人中也檢測(cè)到這兩個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，由此證明轉(zhuǎn)錄本Jak2b和Jak2c是生理性的成熟mRNA。
　　2.轉(zhuǎn)錄本Jak2b是外顯子10的3’端缺失了77個(gè)核苷酸，預(yù)測(cè)形成了421個(gè)氨基酸的截短型蛋白。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本Jak2c是外顯子10全部缺失，預(yù)測(cè)

5、形成了415個(gè)氨基酸的截短型蛋白。
　　3.野生型Jak2轉(zhuǎn)錄本在哺乳動(dòng)物中均有表達(dá)，在低等生物中不表達(dá)，而新轉(zhuǎn)錄本Jak2b和Jak2c在MPN、AL、健康人和新西蘭大白兔中表達(dá)，在SD大鼠、小鼠和低等生物中不表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. Jak2基因除了野生型轉(zhuǎn)錄本Jak2a，還存在轉(zhuǎn)錄本Jak2b和Jak2c。轉(zhuǎn)錄本Jak2b是位于Jak2基因第10外顯子3’端77bp的缺失所致，轉(zhuǎn)錄本Jak2c是Jak2基因第