納豆激酶基因密碼子優(yōu)化設計與合成及在畢赤酵母中的高效表達.pdf

1、納豆激酶（Nattokinase，NK）是由納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis var.natto）產生的一種具有較強溶栓功能的絲氨酸蛋白酶。國內外研究表明，該酶能顯著溶解體內外血栓，明顯縮短纖維蛋白的溶解時間，并具有激活靜脈內皮細胞產生組織型纖溶酶原激活劑（t-PA），降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑（pAI-1）等功能。納豆激酶的溶解血栓功效已得到廣泛確證，但目前還沒有能夠得到很好推廣利用，應用很有限，其原因是市場供給

2、不足以及價格高。利用高效表達系統(tǒng)作為生物反應器，可低成本、規(guī)?；卮罅可a納豆激酶供更多人所用，無疑是解決這一問題的有效方法之一。
　　 本研究應用基因工程和蛋白質工程技術獲得具有自主知識產權的納豆激酶高產工程菌，為納豆激酶作為溶栓藥物的進一步研制和開發(fā)應用提供理論依據和條件，主要工作包括以下內容：
　　 1.從本課題組自主分離篩選的原生質體紫外誘變處理后產酶提高幅度最大的納豆菌誘變株Du115和野生納豆菌BN10基因組

3、DNA中擴增納豆激酶成熟肽基因nkD和nkB，構建重組表達載體pPICZα-A-nkD和pPICZα-A-nkB，DNA序列測定表明，nkD基因與nkB基因相比，有兩處核苷酸發(fā)生了突變（A107G以及C396T），A107G堿基突變導致氨基酸的替代D36G（Asp-Gly）。將兩重組表達載體經SacI線性化后電擊轉化畢赤酵母X-33并實現(xiàn)了分泌表達，對表達產物進行分離純化、酶活性測定及熱穩(wěn)定性檢測。結果表明，納豆激酶DNK與BNK在65

4、℃處理15min，前者的熱穩(wěn)定性提高20％，比活力提高16.6％。對位點變化前后的納豆激酶空間結構進行比較預測，由此可推斷，第36位氨基酸殘基的突變可能與其酶熱穩(wěn)定性及活性提高密切有關。綜合考慮，選擇納豆菌Du115納豆激酶基因作為下一步研究的材料。
　　 2.在不改變納豆激酶DNK氨基酸序列的基礎上，優(yōu)先選擇畢赤酵母最偏愛的密碼子，并參照原有納豆菌DU115納豆激酶基因的密碼子使用情況，部分使用次偏好密碼子，從而盡量消除mRN

5、A穩(wěn)定的二級結構，設計并合成了納豆激酶成熟肽基因（synkD）。所合成的synkD全長為848 bp，克隆入pMD18-T載體上，測序結果表明與預期結果相一致。
　　 3.將人工合成的納豆激酶基因synkD克隆入pPICZα-A質粒，構建分泌型重組酵母表達載體pPICZα-A-synkD，轉化畢赤酵母X-33得到重組子，改造后的synkD表達水平比nkD高3.5倍。對重組蛋白的表達條件進行了優(yōu)化，結果表明：當重組酵母菌在BMGY