人sCD152和sFasL基因克隆表達(dá)及sCD152功能研究.pdf

1、CD152是表達(dá)于活化T細(xì)胞表面的共刺激信號(hào)抑制配體,與抗原遞呈過(guò)程中T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)控有關(guān).FasL屬于腫瘤壞死因子家族,它能傳導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào),誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡.由于CD152和FasL都能下調(diào)病理性T細(xì)胞的活化,所以在器官移植和自身免疫病領(lǐng)域有著很好的前景.以高效分泌表達(dá)CD152膜外可溶性片段(sCD152)畢赤氏酵母菌株為材料,大批量發(fā)酵表達(dá)得到純化蛋白,通過(guò)小鼠體內(nèi)外一系列免疫試驗(yàn)和人體外雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

2、試驗(yàn)結(jié)果顯示sCD152具有顯著的免疫抑制功能.其中以牛血清白蛋白作為抗原免疫小鼠,sCD152組比對(duì)照組的BSA抗體滴度明顯降低;而小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)說(shuō)明sCD152去除后對(duì)初次免疫應(yīng)答并無(wú)明顯抑制,且對(duì)體內(nèi)BSA免疫的sCD152組脾細(xì)胞體外用OVA刺激得到陽(yáng)性結(jié)果,初步證明了sCD152的免疫抑制特異性.為了獲得既帶有純化配體表位又帶有可剪切序列的可溶性sCD152蛋白,我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了含有His-tag和腸激酶識(shí)別切割序列DDD

3、DK的sCD152表達(dá)載體pPIC-HE-sCD152,結(jié)果這一表達(dá)載體在畢赤氏酵母中同樣高效分泌表達(dá)出目的蛋白,大量純化后用腸激酶酶切去除His-tag,用以進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn),初步結(jié)果表明具有體外細(xì)胞免疫抑制功能.為了與sCD152一起誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫耐受,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了sFasL原核表達(dá)載體pBV220-sFasL,得到了高表達(dá)的基因工程BL21菌株,制備了大量純化蛋白,經(jīng)腸激酶剪切后與sCD152一起進(jìn)行了初步的功能實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示s