精氨酸激酶折疊與去折疊機(jī)制研究.pdf

1、精氨酸激酶(ATP：N-精氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶EC2.7.3.3)是無脊椎動物中參與能量代謝的一種重要磷酸激酶。以中國對蝦的精氨酸激酶(40kDa)為模式蛋白，研究了蛋白質(zhì)在六氟異丙醇溶液中的去折疊機(jī)制以及誘導(dǎo)出的二級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)再折疊的影響。 利用內(nèi)源熒光、ANS熒光、遠(yuǎn)紫外-圓二色光譜以及酶活力測定等手段研究了精氨酸激酶在1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇溶液中變性后結(jié)構(gòu)與活性的變化。為避免蛋白質(zhì)聚沉的出現(xiàn)，實驗中采用的變性劑濃

2、度低于8％(v/v)。當(dāng)六氟異丙醇濃度范圍為0.5％-1.5％時，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和內(nèi)源熒光發(fā)射峰位都沒有發(fā)生明顯的變化，而外源ANS熒光強(qiáng)度則顯著增強(qiáng)。繼續(xù)提高變性劑濃度至6％后，內(nèi)源熒光發(fā)射峰位明顯紅移、二級結(jié)構(gòu)含量增大、外源熒光減弱、酶活力完全喪失。比較精氨酸激酶的失活與去折疊過程，結(jié)果表明酶的失活速度明顯快于去折疊的速度。內(nèi)源熒光和外源ANS熒光的變化證明：在0.5％-1.5％六氟異丙醇濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子以一種結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定并

3、類似于天然蛋白結(jié)構(gòu)的熔球態(tài)中間體的狀態(tài)存在。這種熔球態(tài)中間體也是精氨酸激酶在去折疊過程中出現(xiàn)的一個平衡態(tài)中間體。 在脲變性的精氨酸激酶中加入六氟異丙醇溶液，能誘導(dǎo)出大量的二級結(jié)構(gòu)特別是α-螺旋。折疊動力學(xué)研究表明，這些誘導(dǎo)出來的二級結(jié)構(gòu)對精氨酸激酶的再折疊產(chǎn)生阻礙作用，明顯減緩了折疊的速度。而且當(dāng)六氟異丙醇的誘導(dǎo)濃度為5％時，這個阻礙作用是最顯著的，而且再折疊過程中產(chǎn)生了部分不可見的聚沉，蛋白質(zhì)的活力喪失殆盡?？梢?，事先誘導(dǎo)的