嗜熱菌NG80-2芳香烴羥化酶基因的克隆表達(dá)和功能鑒定.pdf

1、嗜熱脫氮芽胞桿菌 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 是從我國(guó)大港油田分離得到的目前世界上唯一已知的嗜熱(最適生長(zhǎng)溫度為65度) 并具有降解重質(zhì)烷烴能力的采油微生物。其基因組全長(zhǎng)3.55Mb，包含一個(gè)57.7kb 質(zhì)粒，共編碼3499個(gè)基因。 原油是一種由長(zhǎng)鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴和一些含硫、氮的化合物組成的復(fù)雜混合物，其中芳香類化合物種類繁多，多數(shù)芳香化合物對(duì)普通細(xì)菌都有抑制性和毒性，是

2、一類很難降解的致癌環(huán)境污染物；部分芳香類化合物含硫、氮，影響原油質(zhì)量并造成環(huán)境污染。研究芳香類化合物的降解，對(duì)于提高原油質(zhì)量、消除污染、降低石油工業(yè)成本都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值；并且，利用微生物降解環(huán)境中芳香類污染物，是當(dāng)前生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。 在完成該菌株全基因組序列破譯、注釋和利用生物信息學(xué)手段分析預(yù)測(cè)該菌株所有相關(guān)的芳香類化合物降解基因基礎(chǔ)之上，本文論述了利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)等方法對(duì)其中的鄰氨基苯甲酸降解途徑中

3、羥化酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和功能鑒定，為揭示NG80-2的芳香類化合物降解途徑提供了有力證據(jù)；同時(shí)，該途徑是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種新的降解途徑，編碼鄰氨基苯甲酸降解基因簇屬NG80-2 基因組通過(guò)掃描發(fā)現(xiàn)的可能的外源基因片斷，外源基因的獲得可能與地下的油藏環(huán)境中養(yǎng)分組成有關(guān)，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化使NG80-2獲得了這種新的代謝途徑，并為其提供氮源和能源，該研究為NG80-2對(duì)環(huán)境的耐受性和適應(yīng)性以及進(jìn)化的探索提供了有利的依據(jù)。 通過(guò)生物信息

4、學(xué)的分析結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，預(yù)測(cè)了NG80-2中鄰氨基苯甲酸降解基因簇和降解途徑，鄰氨基苯甲酸降解基因簇長(zhǎng)約 13kb，除前四個(gè)基因外，其它基因與己報(bào)道的Pseudomonas fluorescens KU-7降解硝基苯甲酸途徑的基因簇有一定的相似性。用熒光定量PCR的方法分析了基因的表達(dá)情況，確定了該基因簇中orf××60屬于芳香化合物羥化酶基因。NG80-2能夠以鄰氨基苯甲酸為唯一碳源生長(zhǎng)，其全細(xì)胞酶活反應(yīng)結(jié)果證明：在60℃時(shí)該菌能降解鄰

5、氨基苯甲酸，其降解速率為0.5mM鄰氨基苯甲酸/克干重細(xì)胞/小時(shí)，但不能降解硝基苯甲酸。利用pET表達(dá)系統(tǒng)在Ecoli BL21中表達(dá)了羥化酶及輔酶基因，并確定了最適表達(dá)條件為0.1mM IPTG，誘導(dǎo)溫度45℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，并在體外反應(yīng)中檢測(cè)了羥化酶活性。進(jìn)一步對(duì)純化的羥化酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)羥化酶必需有還原型輔酶為供氫體；該酶反應(yīng)的最適溫度為60℃，反應(yīng)的最適pH為pH7.5；該酶在20 mmol/L，Kpi B