水稻抗病基因Xa3-Xa26家族的表達(dá)和生化分析.pdf

1、水稻是世界上重要的糧食作物之一，而水稻病害一直是制約水稻產(chǎn)量的重要因素，孫新立(2004)利用圖位克隆法從明恢63中分離克隆了定位于水稻第11染色體上的一個(gè)抗病基因Xa3/Xa26基因，同時(shí)確定Xa3/Xa26是一個(gè)串聯(lián)排列的多基因家族成員，另有研究表明，多個(gè)水稻抗病基因均定位于Xa3/Xa26基因家族相應(yīng)的染色體區(qū)段，這就暗示我們這些尚未鑒定的抗性基因有可能就是Xa3/Xa26基因家族的成員。所以對(duì)家族成員的表達(dá)分析檢測(cè)對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的候

2、選抗病基因具有重要意義。本研究采用RT-PCR(Reverse transcription-PCR)的方法對(duì)水稻品種特青和日本晴中Xa3/Xa26家族的22個(gè)成員進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果表明特青中的TRka，TRkb，TRkc，TRke在成熟葉片中均為組成型表達(dá)，其他成員(TRkd,TRkf,TRkg,TRkh，TRki，TRkj)均不表達(dá)：日本晴中的NRkal，NRka2，NRkd2，NRke，NRkf3在成熟葉片中均為組成型表達(dá)，其他成

3、員(NRkb1，NRkb2，NRkc1，NRkc2，NRkdl，NRkf1，NRkf2)均不表達(dá)。 Xa3/Xa26的基因產(chǎn)物編碼一個(gè)LRR(leucine-rich repeat)受體激酶蛋白，且與抗白葉枯病基因Xa21的編碼產(chǎn)物的同源性很高。目前對(duì)于該類蛋白質(zhì)的翻譯后修飾位點(diǎn)等生化特性研究尚處于起步階段。本研究嘗試?yán)媒湍副磉_(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)XA3/XA26融合蛋白，并將該蛋白分離純化。采用ESI-MS(Electrospray

4、Ionizsation Mass Spectrometry)技術(shù)分析蛋白的糖基化現(xiàn)象以及相應(yīng)的糖基化位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)去糖基化酶處理前后肽段所形成的一級(jí)肽指紋圖譜的比較，共有五條肽段在兩張圖譜中均有出現(xiàn)，對(duì)這些肽段進(jìn)行串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜的測(cè)序分析，可以得出位于這些肽段上預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)(N351，N364，N399，N650，N666)均未被糖基化；在去糖基化肽段圖譜中還發(fā)現(xiàn)有一條差異肽段在原始肽段圖譜中未出現(xiàn)，二級(jí)質(zhì)譜測(cè)序分析表明該肽段為糖基化肽

5、段，糖基化位點(diǎn)是N869或/和N873。 本研究還利用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了特青中Xa3/Xa26基因家族成員TRka部分區(qū)段融合蛋白(TRKaP)，Xa3/Xa26基因的LRR區(qū)融合蛋白(Xa3L/Xa26L)和激酶區(qū)融合蛋白(Xa3K/Xa26K)，并利用與其融合的His標(biāo)簽進(jìn)行分離純化。TRKaP和Xa3L/Xa26L主要是用于制備抗TRKA和XA3/XA26的特異性抗體，利用該抗體可通過(guò)免疫染色的方法更加精確的對(duì)TRka

6、和Xa3/Xa26進(jìn)行亞細(xì)胞定位。Xa3K/Xa26K可用于對(duì)Xa3/Xa26基因的激酶區(qū)活性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)Xa3K/Xa26K進(jìn)行自磷酸化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有自磷酸化現(xiàn)象。 XA3/XA26和家族中其它兩個(gè)完整基因MRKa、MRKc的蛋白序列緊靠LRR區(qū)段兩側(cè)分別都各具有一對(duì)半胱氨酸殘基，殘基間序列遵循保守結(jié)構(gòu)域并且推測(cè)可能促使受體蛋白形成二聚體參與信號(hào)傳導(dǎo)。酵母雙雜交結(jié)果顯示XA3/XA26既沒(méi)有與自身形成同源二聚體，也沒(méi)有與MR