TRBP在RISC中作用的研究.pdf

1、RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是由雙鏈RNA（Double-StrandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被一種稱之為Dicer的核酸酶的作用下，被剪切成含3’端兩個(gè)突出堿基的約21～23nt的小的RNA雙鏈體，稱之為小干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA與Dicer等一些蛋白質(zhì)相互結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），根據(jù)堿基配對(duì)

2、原理特異性識(shí)別與之同源的RNA分子，并將其降解。生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RNA干涉在抗病毒感染免疫、維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性、清除異常RNA和參與基因的表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。鑒于其重要的生物學(xué)功能，RNA干涉已成為研究基因功能及基因靶向治療等方面的重要工具。盡管廣為應(yīng)用，但是RNA干涉的機(jī)制尤其是核心效應(yīng)復(fù)合體RISC的形成過(guò)程尚不清楚。
　　Survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（IAP）成員之一，其基因定位于第17號(hào)染色體，由4個(gè)

3、外顯子和三個(gè)內(nèi)含子組成。Survivin基因編碼蛋白為一種癌胚蛋白，在胚胎組織和各種腫瘤組織中均有表達(dá)。效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶體（EPR-1）為凝血蛋白酶因子?a的受體，其基因也定位于17號(hào)染色體，由1165個(gè)堿基組成，編碼一337個(gè)氨基酸的蛋白，有關(guān)其蛋白表達(dá)的研究較少，目前僅發(fā)現(xiàn)部分血液系統(tǒng)腫瘤中有所表達(dá)。Survivin基因編碼區(qū)與效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶體（EPR-1）基因序列反向互補(bǔ)，這一特征提示一個(gè)共表達(dá)Survivin和EPR-1的細(xì)胞將是

4、我們研究RISC復(fù)合體鏈選擇的天然模型。本文中構(gòu)建的有關(guān)Survivin和EPR-1的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)為研究鏈選擇機(jī)制提供了一定的條件。
　　在2005年，參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi的明星分子TRBP(HIV-1TarRNABindingprotein)躍入人們眼簾。它正是一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白，早在上世紀(jì)末就被人們發(fā)現(xiàn)與HIV病毒對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的抑制作用有關(guān)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，它還被證實(shí)，作為Dicer的伴侶，不可或缺的參與了

5、RNAi。TRBP為含有三個(gè)dsRBD（doublestrandRNAbindingdomain）的蛋白。其中從N端開始的第三個(gè)dsRBD可以和Dicer相互作用。已有研究證實(shí)TRBP、AGO2和DCR在細(xì)胞內(nèi)相互作用。體外實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)也證實(shí)TRBP-AGO2-DCR的復(fù)合物可以加工pre-miRNA、識(shí)別向?qū)ф満碗S從鏈并且形成成熟的RISC。
　　關(guān)于影響siRNA裝載入RISC復(fù)合體的因素已有所研究，但是對(duì)雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRB

6、P鏈選擇的機(jī)制尚無(wú)研究。本研究中正確構(gòu)建了全長(zhǎng)、截短/重組型、突變型TRBP基因的真核表達(dá)載體并篩選到了合適的物細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pFLAG-CMV4、pFLAG-CMV4-TRBP、pFLAG-CMV4-TRBPAB、pFLAG-CMV4-TRBPBC、pFLAG-CMV4-TRBPAC、pFLAG-CMV4-TRBPm到HEK-293細(xì)胞中，檢測(cè)了全長(zhǎng)和各種截短/重組體、突變體的表達(dá)，并且觀察了全長(zhǎng)和各種截短/重組型、突變型TRBP

7、與Dicer，Ago2的相互作用情況，證實(shí)了缺失C片段的TRBP不能與Dicer結(jié)合，為研究TRBP的鏈選擇提供一定的基礎(chǔ)。另外，通過(guò)對(duì)RISC組分的干涉實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ago2在RNAi過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。本文還從HEK-293細(xì)胞天然模型這一新的視角入手，研究RNAi過(guò)程中過(guò)程中效應(yīng)鏈的選擇，分別將適宜劑量的熒光素酶報(bào)告基因載體FL-Survivin、FL-EPR-1以及siRNA轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞，結(jié)果提示在RNAi過(guò)程中存在