諾如病毒P結(jié)構(gòu)域與EV71中和表位的嵌合蛋白及其特征研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是導(dǎo)致5歲以下兒童患手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，同時(shí)該病毒具有嗜神經(jīng)組織的特性，致死率和致殘率都很高。諾如病毒(Norovirus，NoV)是造成兒童和成人非細(xì)菌性急性胃腸炎流行的重要原因。這兩種病毒都對(duì)人類的健康構(gòu)成了不可忽視的威脅，研制有效的疫苗是防治它們最有效的途徑之一。
　　本研究的目的是獲得含有EV71

2、線性中和表位和諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行初步的免疫原性評(píng)價(jià)，主要包括了3個(gè)部分的研究?jī)?nèi)容。第一部分，運(yùn)用基因克隆的技術(shù)，將文獻(xiàn)報(bào)道的3個(gè)EV71線性中和表位以單個(gè)或串聯(lián)的形式分別克隆到含諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)質(zhì)粒中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒;第二部分，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)嵌合蛋白表達(dá)，并用親和純化的方式對(duì)嵌合蛋白進(jìn)行純化;第三部分，用純化后的嵌合蛋白免疫小鼠，通過(guò)免疫印跡、ELISA以

3、及中和試驗(yàn)對(duì)嵌合蛋白的免疫原性進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)。
　　通過(guò)以上3個(gè)部分的研究，我們?nèi)〉昧巳缦陆Y(jié)果:1）成功構(gòu)建了含EV71的3個(gè)單表位、4個(gè)串聯(lián)表位與諾如病毒P結(jié)構(gòu)域嵌合的重組質(zhì)粒;2）這些重組質(zhì)粒在大腸桿菌中所表達(dá)的7個(gè)嵌合蛋白都以部分可溶的形式存在;3）通過(guò)親和純化獲得的P結(jié)構(gòu)域和Pm+SP55-70-28嵌合蛋白都能夠自發(fā)形成直徑約20nm的顆粒，用這兩種蛋白免疫小鼠后獲得的血清抗體滴度分別是1∶32，000、1∶1，024，

4、000;4)免疫印跡分析表明，(i)7個(gè)嵌合蛋白都能與抗諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的抗血清發(fā)生反應(yīng);(ii)除了含單表位SP55和SP28的嵌合蛋白外，其它嵌合蛋白均能與抗EV71的抗血清反應(yīng);(iii)除了P結(jié)構(gòu)域蛋白、含單表位SP55和SP70以及含串聯(lián)表位SP55-70的嵌合蛋白外，其它嵌合蛋白都能與抗Pm+SP55-70-28的抗血清發(fā)生反應(yīng);5）中和試驗(yàn)結(jié)果表明，抗Pm+SP55-70-28小鼠血清的中和抗體效價(jià)約為1∶4。