利用小鼠模型分析A型流感病毒致病性分子基礎(chǔ).pdf

1、近年來A型流感病毒感染人事件頻頻發(fā)生，其中既有人流感病毒人間大流行疫情，如2009年的甲型H1N1流感大流行，也有禽流感病毒跨種傳播感染人的事件，如1997年的香港H5N1亞型高致病性禽流感事件和2013年的H7N9亞型禽流感感染人的事件。上述事件說明A型流感病毒對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，加強(qiáng)對(duì)A型流感病毒哺乳動(dòng)物致病性的研究顯得極為重要。開展A型流感病毒哺乳動(dòng)物致病性分子基礎(chǔ)的研究可為及時(shí)發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)的高致病性流感病毒提供分子標(biāo)

2、記，增強(qiáng)對(duì)流感病毒的監(jiān)測(cè)能力，同時(shí)還可提升對(duì)流感病毒的認(rèn)知。小鼠模型廣泛用于評(píng)價(jià)流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性。本研究通過流感病毒的鼠肺連續(xù)傳代、病毒全基因組測(cè)序、關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)反向遺傳學(xué)驗(yàn)證、動(dòng)物攻毒及體外和體內(nèi)復(fù)制動(dòng)力學(xué)等實(shí)驗(yàn)對(duì)2009年甲型H1N1流感病毒、H1N2亞型禽流感病毒、H3N2亞型禽流感病毒、H5N5亞型禽流感病毒和H5N8亞型禽流感病毒哺乳動(dòng)物致病性分子基礎(chǔ)開展了系列研究。
　　首先，選擇曾引起流感大流行的2009

3、年甲型H1N1流感病毒作為研究目標(biāo)，在通過鼠肺連續(xù)傳代獲得對(duì)小鼠表現(xiàn)出高致病性的毒株的基礎(chǔ)上，通過反向遺傳技術(shù)，拯救出一系列重組甲型H1N1流感病毒，繼而以小鼠體重變化、小鼠生存率、小鼠半數(shù)致死量、病毒組織嗜性、體內(nèi)復(fù)制動(dòng)力學(xué)和體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)等作為指標(biāo)來分析2009年甲型H1N1流感病毒哺乳動(dòng)物強(qiáng)致病性分子基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠感染攜帶PB1-T296R突變位點(diǎn)的重組甲型H1N1流感病毒rXD-PB1-296R后發(fā)病率和死亡率顯著提高

4、;重組病毒rXD-PB1-296R在小鼠肺臟和MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力顯著提高;重組病毒rXD-PB1-296R能在小鼠腦內(nèi)復(fù)制;重組病毒rXD-PB1-296R對(duì)小鼠的毒力較親本病毒提高1000倍。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PB1-T296R突變是已具備高效感染人能力的2009年甲型H1N1流感病毒對(duì)小鼠這一哺乳動(dòng)物模型產(chǎn)生高致病性的分子基礎(chǔ)。
　　在上述研究的基礎(chǔ)上，我們選擇了H1N2、H3N2、H5N5和H5N8亞型禽流感病毒作為研

5、究目標(biāo)開展了禽流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性的分子基礎(chǔ)研究。將H1N2、H3N2、H5N5和H5N8亞型禽流感病毒分別感染BALB/c小鼠并進(jìn)行鼠肺連續(xù)傳代，成功獲得了H1N2、H3N2、H5N5和H5N8亞型禽流感病毒鼠適應(yīng)株，證明H1N2、H3N2、H5N5和H5N8亞型禽流感病毒可通過適應(yīng)性進(jìn)化獲得對(duì)哺乳動(dòng)物高致病性的能力;通過比較H1N2、H3N2、H5N5和H5N8亞型禽流感病毒鼠適應(yīng)株與其對(duì)應(yīng)的親本病毒在致病性上的差別，我們發(fā)現(xiàn)，

6、相較于親本病毒，H1N2、H3N2、H5N5和H5N8亞型禽流感病毒鼠適應(yīng)株具有更強(qiáng)的體內(nèi)和體外復(fù)制能力、更為廣泛的組織嗜性和更強(qiáng)的小鼠致病性;通過對(duì)不同代次的鼠肺分離病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序和致病性實(shí)驗(yàn)等，我們發(fā)現(xiàn)PB2-D701N突變可使H1N2亞型禽流感病毒對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng)至少56倍，PB2-D701N突變可使H3N2亞型禽流感病毒對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng)56倍，PB2-E627K突變可使H5N5和H5N8亞型禽流感病毒對(duì)小鼠的毒力均增強(qiáng)10

7、00倍。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PB2-D701N突變是H1N2和H3N2亞型禽流感病毒對(duì)小鼠這一哺乳動(dòng)物模型產(chǎn)生強(qiáng)致病性的分子基礎(chǔ)，而PB2-E627K突變是H5N5和H5N8亞型禽流感病毒對(duì)小鼠這一哺乳動(dòng)物模型產(chǎn)生強(qiáng)致病性的分子基礎(chǔ)。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)了包括PB1-T296R、PB2-E627K和PB2-D701N在內(nèi)的多個(gè)A型流感病毒小鼠致病性分子標(biāo)記，加深了我們對(duì)A型流感病毒哺乳動(dòng)物致病性分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)和理解，為A型