Wnt-β-catenin信號(hào)通路及B10細(xì)胞對(duì)矽肺Th免疫調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究利用小鼠矽肺模型，通過(guò)氣管灌注β-catenin短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA，shRNA)慢病毒載體懸液阻斷肺部的Wnt/β-catenin信號(hào)通路或者腹腔注射抗小鼠CD22單克隆抗體消除B10細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察矽肺進(jìn)展過(guò)程中不同Th細(xì)胞亞群的數(shù)量及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化，進(jìn)而闡明矽肺發(fā)病過(guò)程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路和B10細(xì)胞對(duì)Th免疫的調(diào)控作用，為探索矽肺的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。<

2、br>　　方法：
　　一、建立Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷模型和B10消除模型
　　C57BL/6小鼠（6-8周，雌性）按體重隨機(jī)分組。非暴露式氣管內(nèi)灌注3×107TUβ-catenin shRNA慢病毒懸液，干擾小鼠肺部的β-catenin表達(dá)，建立Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷模型，使用相同滴度的對(duì)照慢病毒建立對(duì)照模型;通過(guò)腹腔注射300μg anti-CD22 mA特異性消除小鼠體內(nèi)B10細(xì)胞，建立B

3、10消除模型，并使用等體積IgG1同型抗體作為對(duì)照。對(duì)照組和模型組小鼠分別進(jìn)行非暴露式氣管內(nèi)灌注相同體積的生理鹽水和二氧化硅顆粒懸液。將各組小鼠分別于灌注后7、28、56天后處死，收集肺組織、脾組織、肺門淋巴結(jié)(hilar lymph node，HLN)、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，經(jīng)過(guò)相應(yīng)的處理后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
　　二、炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
　　將收集的肺泡灌沈液通過(guò)300

4、0 rpm低溫離心10 min，獲取細(xì)胞并重懸于1 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)制備單細(xì)胞懸液，取10μl細(xì)胞懸液置于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度=（四個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)/4）×104。取400μl細(xì)胞懸液，低溫3000 rpm離心10 min，棄上清，加入20μl小牛血清混勻，吸取5μl推片，室溫晾干后甲醇固定，待甲醇晾干后使用Wright-Giemsa染液進(jìn)行雙染，室溫染色10

5、 min后蒸餾水沖洗玻片背面。顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的數(shù)量。
　　三、病理切片染色
　　肺組織常規(guī)石蠟切片(5μm)進(jìn)行蘇木素伊紅(Hematoxyln&Eosin，H&E)染色?？酒?石蠟切片放入烘箱內(nèi)60℃烘烤2h。脫蠟:將切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。脫二甲苯:梯度酒精由高濃度至低濃度浸泡各5 min，最后用流水沖洗。細(xì)胞核染色:蘇木素染液浸染10 min，流水沖洗。分

6、化:2％鹽酸酒精浸泡20 s至1 min，流水沖洗。返藍(lán):自來(lái)水浸泡2h。細(xì)胞漿染色:0.5％伊紅染液浸染1至2 min，流水沖洗。脫水:梯度酒精由低濃度至高濃度浸泡各5 min。透明:二甲苯Ⅱ浸泡10 min，換到二甲苯Ⅰ再浸泡10 min。封片:從二甲苯中取出后馬上滴加中性樹膠并使用蓋玻片封片。
　　肺組織常規(guī)石蠟切片（5μm）進(jìn)行Masson染色。烤片:石蠟切片放入烘箱內(nèi)60℃烘烤2h。脫蠟:將切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸

7、泡10 min。脫二甲苯:梯度酒精由高濃度至低濃度浸泡各5 min，最后用流水沖洗。細(xì)胞核染色:蘇木素染液浸染10 min，流水沖洗。分化:2％鹽酸酒精浸泡20 s至1 min，流水沖洗。肌纖維染色:麗春紅酸性復(fù)紅溶液浸染5 min，0.2％冰醋酸浸洗片刻。分化:1％磷鉬酸溶液浸染5 min。膠原纖維染色:苯胺藍(lán)染液浸染5 min，0.2％冰醋酸浸洗片刻。脫水:梯度酒精由低濃度至高濃度浸泡各5 min。透明:二甲苯Ⅱ浸泡10 min，換

8、到二甲苯Ⅰ再浸泡10 min。封片:從二甲苯中取出后馬上滴加中性樹膠并使用蓋玻片封片。
　　四、流式細(xì)胞術(shù)
　　取脾、肺門淋巴結(jié)細(xì)胞各1×106加入1 ml含有胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的1640培養(yǎng)基中，加入2μl刺激劑37℃培養(yǎng)5h后收集細(xì)胞，staining buffer清洗兩次，表面染色;staining buffer清洗兩次，固定-破膜液孵育細(xì)胞;固定-破膜緩沖液清洗細(xì)胞兩次，細(xì)胞內(nèi)染

9、色;staining buffer清洗兩次，加入300μl1％多聚甲醛重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Diva軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　一、阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路加重矽肺炎癥并減輕纖維化
　　使用慢病毒阻斷Wnt/β-catenin通路后，二氧化硅顆粒誘導(dǎo)的矽肺炎癥明顯加重。早期時(shí)間點(diǎn)慢病毒處理組小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6大量分泌，顯著

10、高于模型組與對(duì)照病毒組;隨著疾病進(jìn)展，模型組與對(duì)照病毒組的炎癥逐漸消退，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞減少，肺泡壁發(fā)生增厚并出現(xiàn)細(xì)胞性結(jié)節(jié)，而慢病毒處理組在28、56天依然處于炎癥階段，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)，由于炎癥持續(xù)存在，纖維化的發(fā)生受到了抑制，56天時(shí)慢病毒處理組的膠原沉積明顯較輕。
　　二、阻斷Wnt/β-catenin-號(hào)通路可以促進(jìn)Th17反應(yīng)
　　早期炎癥階段，慢病毒處理組小鼠Th17反應(yīng)顯著增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)Th17細(xì)胞進(jìn)

11、行分析，結(jié)果顯示早期炎癥階段CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例顯著增加，其特異性細(xì)胞因子Il17a、Il21 mRNA表達(dá)水平也有顯著增高。調(diào)控Th17分化增殖的細(xì)胞因子中，Il6 mRNA在7天時(shí)間點(diǎn)的大量表達(dá)是Th17細(xì)胞增多的主要原因，而Il23在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與模型組、對(duì)照病毒組相比沒有差異。
　　三、阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路延緩Th1向Th2極化的過(guò)程
　　阻斷wnt信號(hào)通路后，Th1反應(yīng)增強(qiáng)，其中T

12、h1細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例在7天、56天都顯著高于模型組和對(duì)照病毒組，Th1特異性細(xì)胞因子Ifng mRNA在7天也有明顯升高。Th2細(xì)胞的特異性核轉(zhuǎn)錄因子Gata3及其表達(dá)的促纖維化因子Il4、Il13 mRNA在56天均明顯低于模型組和對(duì)照病毒組。因此，在矽肺的疾病進(jìn)展過(guò)程中，晚期纖維化階段慢病毒處理組Th2反應(yīng)受到抑制，同時(shí)Th1反應(yīng)仍處于較高水平，使Th1向Th2極化的過(guò)程發(fā)生延緩，最終導(dǎo)致纖維化程度減輕。
　　四、阻

13、斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)抑制Tregs調(diào)控Th免疫反應(yīng)
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，慢病毒處理組Tregs在7天顯著減少，通過(guò)RealtimeRT-PCR檢測(cè)Tregs特異性核轉(zhuǎn)錄因子顯示，F(xiàn)oxp3 mRNA在7天同樣顯著減少，與Tregs的趨勢(shì)相一致。同時(shí)，Tregs表達(dá)的抑制性細(xì)胞因子Tgfb和Il10 mRNA在7、56天均低于模型組和對(duì)照病毒組。因此，阻斷Wnt信號(hào)通路可以抑制Tregs及其所分泌的細(xì)胞因子，

14、引起Tregs介導(dǎo)的免疫抑制能力降低。
　　五、B10細(xì)胞參與調(diào)控矽肺炎癥纖維化
　　對(duì)小鼠進(jìn)行氣管內(nèi)灌注二氧化硅懸液后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺門淋巴結(jié)內(nèi)及脾組織內(nèi)B10細(xì)胞的含量，結(jié)果顯示模型組小鼠在7、28、56三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的B10細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組。提示B10細(xì)胞參與調(diào)控矽肺的炎癥和纖維化。此外，腹腔注射anti-CD22單克隆抗體后，灌注了二氧化硅的小鼠肺門淋巴結(jié)和脾組織內(nèi)的B10細(xì)胞含量較模型組顯著減少，證明an

15、ti-CD22單克隆抗體可以有效消除小鼠體內(nèi)的B10細(xì)胞。
　　六、消除B10細(xì)胞加重矽肺的炎癥并減輕纖維化
　　病理結(jié)果顯示，矽肺小鼠在消除B10細(xì)胞后，早期的矽肺炎癥相相較于模型組明顯加重，肺泡滲出液及炎性細(xì)胞聚集增多。此外，7天時(shí)間點(diǎn)B10細(xì)胞消除組小鼠的肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)以及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6也顯著高于模型組，其中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果證明B10細(xì)胞消除可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的大量聚集。28天時(shí)肺部炎癥逐漸減輕，

16、模型組開始出現(xiàn)小的細(xì)胞結(jié)節(jié)和肺泡壁增厚，而B10細(xì)胞消除的矽肺小鼠未出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)節(jié)，仍處于炎癥階段。56天時(shí)小鼠的矽肺炎癥基本消失，模型組小鼠出現(xiàn)較大的細(xì)胞性結(jié)節(jié)，B10細(xì)胞消除組可見小的細(xì)胞結(jié)節(jié)，肺泡壁增厚相對(duì)較輕。Masson染色顯示B10細(xì)胞消除組小鼠肺部膠原沉積相對(duì)較輕，同時(shí)經(jīng)Realtime PCR測(cè)定，促纖維化細(xì)胞因子TGF-β mRNA表達(dá)量在28、56天均顯著低于模型組。
　　結(jié)論：
　　1、阻斷Wnt/β-c