MiR-661-RB1-E2F1信號軸調(diào)控非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　肺癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，現(xiàn)有研究表明miR-661在乳腺癌、卵巢癌及腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著抑制或促進(jìn)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等作用，但在肺癌等腫瘤中的作用及分子機(jī)制少有報道。本課題擬明確miR-661在NSCLC中的表達(dá)情況，預(yù)測其作用靶點，通過體內(nèi)外實驗，研究miR-661在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.miR-661在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

2、
　　通過挖掘生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫找到miR-661肺癌芯片(芯片號:GSE15008/GP/L8176/989)并進(jìn)行分析，熒光定量RT-PCR方法檢測miR-661在50對肺癌與癌旁組織中的表達(dá);檢測正常肺上皮細(xì)胞EBAS-2B及7種肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A1、H460、GLC-82、PC-9、H1299和H322中miR-661表達(dá)。
　　2.miR-661靶基因的篩選、鑒定
　　3.miR-661對非小細(xì)胞肺

3、癌細(xì)胞的體內(nèi)、體外生物學(xué)特性的影響
　　1)通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-661過表達(dá)和干擾片段，同時使用慢病毒包裝系統(tǒng)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549和SPC-A1細(xì)胞，建立過表達(dá)miR-661的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，在體外使用CCK8細(xì)胞增殖實驗、平板克隆形成實驗、細(xì)胞周期實驗，以及劃痕實驗和Transwell遷移實驗，檢測miR-661過表達(dá)和干擾后對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和SPC-A1細(xì)胞在克隆形成、增殖、遷移和運動能力的影響。
　　2)采用裸

4、鼠皮下成瘤實驗和尾靜脈注射實驗檢測miR-661過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株A549對體內(nèi)非小細(xì)胞肺癌成瘤和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.miR-661參與的非小細(xì)胞肺癌作用的機(jī)制研究
　　利用Western blot檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A1中miR-661瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)、干擾和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)后EMT相關(guān)指標(biāo)的變化;利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染RB1cDNA和RB1si后E2F1和E-cadherin的變化;利用

5、Western blot檢測轉(zhuǎn)染E2F1cDNA后Vimetin、Fibronectin的變化;利用免疫熒光技術(shù)檢測miR-661瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)片段后EMT相關(guān)指標(biāo)定位情況;利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)驗證RB1與其下游轉(zhuǎn)錄因子E2F1的相互作用。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　結(jié)果：
　　(1)miR-661在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)。
　　基因芯片分析結(jié)果得出，與癌旁組織相比，miR-661在60.9％（67/110例）

6、的肺癌組織中表達(dá)上調(diào)(t=-2.931，p=0.004);50對肺癌組織中，與癌旁組織相比，miR-661在34對癌組織中表達(dá)上調(diào)(P＜0.001)，上調(diào)倍數(shù)為7.26倍。
　　(2)相對于正常肺上皮細(xì)胞，miR-661在NSCLC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。
　　熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示:在EBAS-2B及A549、SPC-A1、H460、GLC-82、PC-9、H1299和H322七種細(xì)胞之間，miR-661在7種非小細(xì)胞

7、肺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于EBAS-2B(P＜0.01，P＜0.001)。我們選擇表達(dá)相對較高的A549和SPC-A1進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　2.miR-661的靶基因預(yù)測、鑒定。
　　1)采用miRNA靶基因預(yù)測軟件(TargetScan、RNA22、microRNA.map、Pita和miRwalk)預(yù)測miR-661的靶基因，以miR-661為關(guān)鍵詞，挑選五個數(shù)據(jù)庫皆有交集且查閱文獻(xiàn)證實在非小細(xì)胞肺癌中為抑癌基因，最終確定RB1

8、為miR-661的靶基因。
　　2)熒光定量RT-PCR檢測RB1mRNA在肺癌組織中的表達(dá)，RB1mRNA在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，相關(guān)分析表明miR-661與RB1mRNA在肺癌癌組織中的表達(dá)存在負(fù)性相關(guān)（P＜0.000，r=-0.870）。Western Blot檢測RB1在NSCLC細(xì)胞株和8對NSCLC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)。與肺上皮細(xì)胞相比，RB1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中大部分表達(dá)下調(diào);與癌旁組織相比，在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)

9、。
　　3)成功構(gòu)建Wt RB13'UTR和Mut RB13'UTR雙熒光素酶報告載體，表明miR-661可以特異的結(jié)合于RB13'UTR。
　　4)免疫熒光實驗結(jié)果證實，在A549和SPC-A1細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-661過表達(dá)片段后觀察RB1，可見RB1定位于對照組膜上，而過表達(dá)組表達(dá)不明顯;說明RB1是miR-661的直接靶點。
　　3.miR-661抑制RB1的表達(dá)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的生長和轉(zhuǎn)移。

10、>　　1)成功構(gòu)建過表達(dá)miR-661的穩(wěn)定細(xì)胞株A549/LV-miR-661和SPC-A1/LV-miR-661。
　　2) Western blot實驗結(jié)果表明:瞬時過表達(dá)miR-661之后，A549和SPC-A1細(xì)胞中RB1的蛋白水平表達(dá)下調(diào)。
　　3)CCK-8細(xì)胞增殖實驗表明:瞬轉(zhuǎn)miR-661過表達(dá)和干擾片段后，與Control組相比，過表達(dá)miR-661促進(jìn)A549和SPC-A1細(xì)胞的增殖(P＜0.001;

11、P＜0.001);而干擾miR-661后則抑制A549和SPC-A1細(xì)胞的增殖(P＜0.001; P＜0.001)。Transwell和劃痕實驗表明:過表達(dá)miR-661之后，與Control相比，A549和SPC-A1細(xì)胞遷移和運動能力增強(qiáng)(P＜0.001;P＜0.001);干擾miR-661后，A549和SPC-A1細(xì)胞遷移和運動能力減弱(P＜0.001;P＜0.001)。
　　4)與LV-NC相比，穩(wěn)定過表達(dá)miR-661促

12、進(jìn)A549和SPC-A1細(xì)胞的增殖能力(P＜0.001; P＜0.001)，克隆形成能力(P＜0.001;P＜0.001)，遷移(P＜0.001; P＜0.001)和運動能力(P＜0.001; P＜0.001)。
　　5)恢復(fù)實驗表明:與Control相比，過表達(dá)miR-661之后，A549和SPC-A1細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P＜0.001;P＜0.001)，而共表達(dá)miR-661/RB1cDNA之后，A549和SPC-A1細(xì)胞的遷移

13、能力減弱(P＜0.001;P＜0.001)。
　　6)裸鼠皮下成瘤實驗顯示:與A549/LV-NC組相比，A549/miR-661組皮下腫瘤生長速度明顯增加(P＜0.001);皮下瘤組織westernblot結(jié)果顯示:在A549/miR-661組，靶基因RB1、E-cadherin表達(dá)下調(diào);E2F1、Vimentin表達(dá)上調(diào)，增殖指數(shù)Ki-67表達(dá)呈強(qiáng)陽性。
　　7)裸鼠尾靜脈注射實驗顯示:A549/miR-661組肺轉(zhuǎn)移結(jié)

14、節(jié)數(shù)較對照組增多，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目有明顯差異(T=-6.686，P=0.001;)，在其他臟器中均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。
　　4.miR-661、RB1和E2F1調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌作用機(jī)制的初步探討
　　1)結(jié)果表明RB1失活、E2F1激活可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌EMT過程。
　　2)免疫熒光實驗檢測A549和SPC-A1兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，瞬時轉(zhuǎn)染miR-661過表達(dá)片段后觀察EMT相關(guān)分子標(biāo)志物定位情況，結(jié)果顯示:上皮標(biāo)志物E

15、-cadherin定位于對照組細(xì)胞膜上，β-catenin定位于對照組核內(nèi);間葉標(biāo)志物(Vimetin、Fibronectin)定位于miR-661過表達(dá)組細(xì)胞胞漿;與對照組相比，miR-661過表達(dá)組的上皮標(biāo)志物定位不明顯;而間葉指標(biāo)(Vimetin、Fibronectin)定位明顯，說明EMT是miR-661調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌作用中的重要過程。同時可以觀察到E2F1定位于miR-661過表達(dá)組細(xì)胞漿內(nèi)，說明E2F1參與miR-661的

16、生物學(xué)過程。
　　3)利用免疫共沉淀實驗檢測RB1與其下游轉(zhuǎn)錄因子E2F1的直接結(jié)合作用，結(jié)果顯示:RB1與其下游轉(zhuǎn)錄因子E2F1存在直接的相互作用。說明RB1與其下游轉(zhuǎn)錄因子E2F1共同參與了miR-661介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。
　　結(jié)論：
　　1.miR-661在NSCLC癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-661具有增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力;初步推斷miR-661在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)