微小RNA-125A-5p在頭頸鱗癌中的表達(dá)及其在頭頸鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、目的:
　　頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是發(fā)生在頭頸部區(qū)域發(fā)病率最高的惡性腫瘤，數(shù)據(jù)顯示約50％的患者明確診斷時(shí)就處于疾病的晚期。而相關(guān)研究表明，HNSCC患者（特別是局部晚期患者）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，所以探索HNSCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)疾病的治療工作具有重要的意義，有助于對(duì)HNSCC的預(yù)防及診治。
　　C-C型趨化因子受體7(CCR7)是一種重要的趨化因子的，屬于趨化因子C-C的亞型，在多種腫瘤細(xì)胞

2、表面均有表達(dá)，如白血病、淋巴瘤，淋巴增生綜合征以及一些上皮源性的惡性腫瘤。通過(guò)與其配體21(CCL21)和19(CCL19)共同作用促進(jìn)腫瘤遷移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本課題組以往研究結(jié)果與其他相關(guān)研究成果共同表明，CCR7可通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑作用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　此外，我們將構(gòu)建hsa-miR-125a-5p過(guò)表達(dá)真核質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染PCI-37B細(xì)胞，通過(guò)體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及PCI-37B細(xì)胞中hsa-miR-125a-

3、5p對(duì)CCR7表達(dá)影響的檢測(cè)，來(lái)探討hsa-miR-125a-5p在頭頸部鱗癌中的作用。最終能夠初步闡明hsa-miR-125a-5p表達(dá)在HNSCC中作用和意義，并為hsa-miR-125a-5p作為HNSCC的治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。
　　方法:
　　1、細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)
　　HNSCC的PCI-37B細(xì)胞系具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并能夠明顯表達(dá)CCR7蛋白，該細(xì)胞系由匹茲堡大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)。細(xì)胞生長(zhǎng)在含10％胎

4、牛血清、100U/mL青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％ CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞匯合80％時(shí)用0.25％胰蛋白酶消化。
　　2、質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　設(shè)計(jì)構(gòu)建miR-125a-5p真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染PCI-37B細(xì)胞，并用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中是否成功過(guò)表達(dá)miR-125a-5p基因。
　　3、總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
　　高純度總RNA快速

5、提取試劑盒用于分離提取細(xì)胞和組織樣本的總RNA，qRT-PCR法檢測(cè)miR-125a-5p與參考基因U6的表達(dá)。采用相對(duì)定量的模式對(duì)三重復(fù)試驗(yàn)測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
　　4、CCK-8實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后增殖、侵襲及遷移能力的變化
　　在96孔板中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前后的三組細(xì)胞。當(dāng)?shù)竭_(dá)特定的時(shí)間時(shí)加入10μl CellCounting Kit-8(CCK-8)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值，對(duì)數(shù)

6、據(jù)進(jìn)行分析，判斷細(xì)胞增殖的變化。
　　Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中將事先鋪好Matrigel膠膜的小室放入24孔板。下室添加800μL含20％ FBS的DMEM培養(yǎng)液;將200μl細(xì)胞懸液加入到上室，細(xì)胞數(shù)量為2×104/孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)侵襲至膠膜下的細(xì)胞。分別選取各個(gè)樣本中5個(gè)視野并取它們的平均數(shù)。
　　3組細(xì)胞更換為無(wú)血清培養(yǎng)基含1μg/mL絲裂霉素C。細(xì)胞劃痕是由200μl移液管尖部制作。在0

7、h、6h、12h、24 h分別通過(guò)顯微鏡觀察并拍照記錄細(xì)胞的位置，計(jì)算每個(gè)組的遷移距離。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中將小室放入24孔板。下室添加800μL含20％ FBS的DMEM培養(yǎng)液;將200μl細(xì)胞懸液加入到上室，細(xì)胞接種數(shù)量為2×104/孔。培養(yǎng)24 h顯微鏡計(jì)數(shù)遷移至下室的細(xì)胞。分別選取各個(gè)樣本中5個(gè)視野并取它們的平均數(shù)。共同檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　5、蛋白提取及Western blot檢測(cè)
　　利用總蛋白提

8、取試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒提取總蛋白并測(cè)定其濃度。Western Blot實(shí)驗(yàn)以內(nèi)參抗體β-actin和CCR7抗體分別為一抗，并以羊抗兔IgG-HRP為二抗，分析CCR7的表達(dá)。凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描目標(biāo)條帶，并對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析。
　　6、病例及標(biāo)本
　　收集2014年8月～2016年5月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面-頭頸外科接受手術(shù)治療、并經(jīng)病理明確診斷為鱗狀細(xì)胞癌的30例患者腫瘤原發(fā)灶和癌旁非腫瘤組織，組

9、織離體后短時(shí)間內(nèi)用液氮冷凍并保存。所有患者及家屬均在標(biāo)本收集前簽署知情同意書。
　　7、生存分析
　　在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載頭頸鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)信息以及患者相應(yīng)的hsa-miR-125a-5p表達(dá)譜數(shù)據(jù)。高通量測(cè)序平臺(tái)BCGSC IlluminaGA miRNASeq和BCGSC IlluminaHiSeq miRNASeq中（最終數(shù)據(jù)下載日期:2014年6月20日）共有397名患者，同時(shí)具有microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及

10、臨床生存數(shù)據(jù)，我們使用這397個(gè)病例的hsa-miR-125a-5p表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。
　　8、統(tǒng)計(jì)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過(guò)至少三個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，表示為x±s，組間差異采用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。生存數(shù)據(jù)矩陣分析hsa-miR-125a-5p表達(dá)與腫瘤分期和生存時(shí)間之間的關(guān)系。Kaplan-Meier(K-M)總體生存曲線差異的顯著性用Log Rank檢驗(yàn)。結(jié)果數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0及Graphpad P

11、rism5.0分析及繪圖，以P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、miRNA-125a-5p過(guò)表達(dá)對(duì)HNSCC細(xì)胞中趨化因子受體7及細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響
　　(1)qRT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后的PCI-37B細(xì)胞表明:陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miRNA-125a-5p的表達(dá)顯著高于其他兩對(duì)照組(p＜0.01)。說(shuō)明miRNA-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。
　　(2)Western bl

12、ot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所得的PCI-37B細(xì)胞中CCR7蛋白表達(dá)，電泳條帶的灰度分析表明:PCI-37B miR-125a-5p+組細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組PCI-37B細(xì)胞和陰性轉(zhuǎn)染組PCI-37B miR-125a-5p-細(xì)胞(p＜0.01)。說(shuō)明miRNA-125a-5p與CCR7之間存在正向調(diào)控關(guān)系。
　　(3)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后三組PCI-37B細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的450 nm OD值變化，統(tǒng)計(jì)結(jié)果

13、表明37BmiR-125a-5p+組在各時(shí)間點(diǎn)生存細(xì)胞數(shù)顯著高于其他兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。即PCI-37B中過(guò)表達(dá)miRNA-125a-5p能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　(4)在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后侵襲能力變化的結(jié)果提示:PCI-37B細(xì)胞陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組的侵襲能力明顯強(qiáng)于其他兩對(duì)照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。結(jié)果提示過(guò)表達(dá)miRNA-125a-5p能夠明顯增強(qiáng)PCI-

14、37B的侵襲能力。
　　(5)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示PCI-37B細(xì)胞陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組的遷移能力顯著強(qiáng)于空白對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移情況的分析結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miRNA-125a-5p的PCI-37B細(xì)胞遷移率在各時(shí)間點(diǎn)均高于其他兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。說(shuō)明PCI-37B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-125a-5p，能夠顯著提高癌細(xì)胞的遷移能力。

15、
　　2、miRNA-125a-5p在頭頸鱗癌組織中表達(dá)的臨床意義
　　(1)熒光定量PCR檢測(cè)HNSCC原發(fā)灶組織和相應(yīng)癌旁正常組織miRNA-125a-5p的表達(dá)量，結(jié)果顯示頭頸鱗癌原發(fā)灶中miRNA-125a-5p表達(dá)量與相應(yīng)癌旁正常組織存在明顯差異。
　　(2)對(duì)不同臨床分期患者miRNA-125a-5p的表達(dá)值進(jìn)行分析，檢驗(yàn)結(jié)果表明在Ⅲ&Ⅳ期患者中miRNA-125a-5p表達(dá)值顯著低于Ⅰ&Ⅱ期患者miRNA

16、-125a-5p表達(dá)值(P＜0.05)
　　(3)根據(jù)患者生存時(shí)間數(shù)據(jù)繪制K-M生存曲線，結(jié)果顯示miRNA-125a-5p低表達(dá)組患者預(yù)后生存時(shí)間較長(zhǎng)。Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果提示兩組樣本生存時(shí)間之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、構(gòu)建miRNA-125a-5p真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)，成功轉(zhuǎn)染頭頸部鱗狀細(xì)胞癌PCI-37B細(xì)胞系。并通過(guò)Western Blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR

17、NA-125a-5p后PCI-37B細(xì)胞，結(jié)果顯示CCR7蛋白的表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明二者之間存在正向調(diào)控關(guān)系。
　　2、相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組PCI-37B細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)miRNA-125a-5p的PCI-37B細(xì)胞增殖、侵襲、遷移方面的能力均顯著增強(qiáng)，提示過(guò)表達(dá)的miRNA-125a-5p具有增強(qiáng)頭頸部鱗癌惡性生物學(xué)行為的作用。
　　3、miRNA-125a-5p在HNSCC組織及癌旁非腫瘤組織中