Annexin A1在急性髓系白血病細胞中的功能研究.pdf

1、白血病是一類造血干細胞異常增殖的惡性血液腫瘤，分為急性髓系白血病，急性淋巴系白血病，慢性髓系白血病，慢性淋巴系白血病。在年齡為0-14歲的孩童中，白血病是最常被診斷出的癌癥類型，其人數(shù)占各類癌癥總?cè)藬?shù)的35％，且白血病的發(fā)病率逐年呈上升趨勢。目前，大部分急性髓系白血病不能得到很好的控制，存在治療藥物種類少、靶向性差、不能完全達到預期治療效果等問題。因此，尋找并開發(fā)更為有效的白血病治療藥物、降低藥物毒副作用、提高治愈率始終是白血病研究領域

2、亟待解決的科學問題。Annexin A1是一種膜聯(lián)蛋白，參與了體內(nèi)多種病理生理過程。前期研究報道Annexin A1在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達，可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但目前未見AnnexinA1在髓系白血病中的相關研究報道。本論文將收集急性髓系白血病患者外周血樣和正常志愿者外周血樣，采用Western blot方法檢測AnnexinA1在白血病患者外周血中的表達水平;通過構(gòu)建Annexin A1敲降表達的急性髓系白血病細胞模型（選用

3、KG-1a和HL60兩種細胞系），在細胞和分子水平明確Annexin A1在急性髓系白血病增殖中的功能，并初步闡明其分子機制;采用已構(gòu)建好的Annexin A1敲降表達的急性髓系白血病細胞模型以及親本細胞構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，在動物水平對Annexin A1的功能進行進一步的研究。
　　本研究收集了2014年至2017年期間在浙江省人民醫(yī)院接受住院治療的37例白血病初治患者外周血作為研究對象，通過紅細胞裂解方法提取白細胞，然后蛋白樣品

4、進行SDS-PAGE電泳后進行免疫印跡檢測，研究結(jié)果顯示，與正常人相比，白血病患者外周血白細胞中Annexin A1蛋白表達量顯著高于正常人。在Annexin A1敲降表達的KG-1a和HL60細胞模型中，研究結(jié)果顯示Annexin A1基因被干擾后，KG-1a和HL60細胞中的Annexin A1蛋白表達顯著下調(diào)，與親本和對應的空載細胞相比，KG-1a-shAnnexin A1和HL60-shAnnexinA1增殖速率明顯降低，倍增時

5、間明顯變長，表明AnnexinA1蛋白有促進急性髓系白血病細胞增殖的功能。流式細胞術檢測細胞周期，結(jié)果顯示，Annexin A1敲降表達后促使KG-1a細胞周期阻滯在G0/G1期。細胞凋亡結(jié)果顯示，AnnexinA1表達受干擾后不會促進細胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示，急性髓系白血病細胞KG-1a中的Annexin A1表達敲降表達后，Notch信號通路中的Notch1和p15蛋白的表達顯著上調(diào)。通過進一步免疫細胞化學研究發(fā)現(xiàn)

6、Annexin A1和Notch1在KG-1a和HL60細胞膜上共定位，免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示在KG-1a細胞中Annexin A1和Notch1存在相互作用。考慮到Annexin A1敲降表達后會顯著提高Notch1的表達水平，故我們推測AnnexinA1與Notch1的相互作用可能促進了Notch1在細胞內(nèi)的降解。為了驗證此假設，我們選用泛素化降解途徑阻斷劑氯喹(chloroquine)來處理KG-1a細胞，Western blot

7、結(jié)果顯示，經(jīng)chloroquine刺激后，KG-1a細胞內(nèi)Notch1表達量顯著上調(diào)，提示在KG-1a中Annexin A1與Notch1相互作用后通過泛素化途徑促進了Notch1的降解;且MTT實驗結(jié)果顯示chloroquine會時間和劑量依賴性地抑制KG-1a細胞增殖，提示在KG-1a細胞中經(jīng)chloroquine處理后上調(diào)Notch1的表達會抑制KG-1a細胞增殖。在KG-1a細胞和KG-1a-shAnnexin A1細胞構(gòu)建的荷