大西洋表層海水烷烴降解菌及其烷烴羥化酶CYP153A基因的多樣性分析.pdf

1、當(dāng)前，海洋的石油污染正在日趨加劇，對(duì)海洋環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成了長(zhǎng)期和惡劣的影響。利用微生物的降解作用來(lái)主動(dòng)清除溢油是當(dāng)今非常重要的環(huán)境生物修復(fù)技術(shù)。因此，烷烴降解菌的分離、鑒定及其降解機(jī)制（烷烴羥化酶）的研究，無(wú)論是作為基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究都有著非常重要的意義。 本論文以柴油和原油混合物（1：1）為碳源，采用了單菌分離培養(yǎng)和DGGE相結(jié)合的方法研究了20個(gè)橫跨大西洋的表層海水樣品的石油降解菌組成。經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)，從20個(gè)石油降解菌

2、群中分離篩選得到197株不同細(xì)菌，分屬于48個(gè)屬，表現(xiàn)出了很高的種屬豐度。降解菌群中可培養(yǎng)菌的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，變形菌綱、放線(xiàn)菌類(lèi)群、CFB類(lèi)群以及厚壁菌門(mén)的細(xì)菌組成了該海域特定的微生物生態(tài)群落，其中尤以變形菌綱α和γ亞群數(shù)目居多。此外，還分離到了33株潛在的新種。PCR—DGGE分析表明，20個(gè)菌群中可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)降解菌為Alcanivorax、Thalasspospira、Marinobacter、Novosphin

3、gobium、Salinisphaera、Erythrobacter和Parvibaculum，未培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌主要仍為Alcanivorax和Thalasspospir屬菌，其次為Salinisphaera、Bortnella和Zymomona屬菌等。單菌驗(yàn)證結(jié)果表明，大部分細(xì)菌都具有較好的柴油降解能力。其中，Salinisphaera屬菌為潛在的新的烷烴降解菌。此外，Halomonas、Tistrella和Martelella屬菌在這些

4、菌群中也經(jīng)常出現(xiàn)，但并不作為菌群的優(yōu)勢(shì)菌存在，單菌油降解能力都很弱。而B(niǎo)ortnella和Zymomona屬菌雖然是菌群優(yōu)勢(shì)菌，但都未能獲得純培養(yǎng)。此外，還分離篩選得到1株能夠很好降解C10～C36直鏈烷烴的Gordonia菌株S14—10，根據(jù)16S rRNA基因、看家基因secAl和生理生化特性初步確定其為該屬的一個(gè)新種，同時(shí)還克隆分析其烷烴降解基因alkB和P450。 通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從19個(gè)屬的68株細(xì)菌中擴(kuò)增獲得了

5、87個(gè)烷烴羥化酶CYP153 P450基因片段。其中，12個(gè)屬的細(xì)菌為首次發(fā)現(xiàn)含有P450基因，包括Bacillus、Brachybacterium、Halomonas、Idiomarina、Leifsonia、Martelella、Mesorhizobium、Ochrobactrum、Salinisphaera、Sphingobium、Tetrathiobacter、Tistrella以及Solimonas屬。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這些P

6、450序列多種多樣，形成多個(gè)進(jìn)化分枝，其中多數(shù)與Alcanivorax來(lái)源的P450同源性較高。Salinisphaera屬菌里擴(kuò)增到的P450基因較為新穎，在進(jìn)化樹(shù)上聚成了一個(gè)獨(dú)立的小分支。此外，許多進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株都擴(kuò)增到了相同或者相近的P450基因，體現(xiàn)了基因的水平轉(zhuǎn)移。再者，Parvibaculum、Erythrobacter、Sphingobium、Tistrella、Bacillus屬的10株菌還發(fā)現(xiàn)了存在多個(gè)P450基因

7、。 本文還對(duì)分離自不同海域的11株P(guān)arvibaculum屬細(xì)菌，以16S rRNA、看家基因rpoD以及重復(fù)PCR為基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些16S rRNA和rpoD序列相近的菌株其重復(fù)PCR帶型差異較大，說(shuō)明了重復(fù)PCR技術(shù)的可靠性與靈敏性，同時(shí)也反映了其生境不同而造成的進(jìn)化上的差異。此外，本文對(duì)該屬11株菌的CYP153 P450基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆文庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)每株菌都包含4～6個(gè)P450序列。實(shí)時(shí)熒光

8、定量PCR分析表明，菌株P(guān)arvibaculum sp. S18—4的6個(gè)P450基因中只有P450—2和P450—4能在Clo和C14烷烴誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)，其它基因不表達(dá)或下調(diào)表達(dá)。它們是否編碼有功能的烷烴羥化酶、是否負(fù)責(zé)其它底物的降解還有待下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 本論文對(duì)橫跨大西洋的表層海水樣品中的20個(gè)石油降解菌群進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，獲得了豐富的石油烴降解微生物以及降解基因資源。這些結(jié)果有助于我們了解石油在海洋環(huán)境中的歸宿，也為進(jìn)