DC-CIK逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3-DDP多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類藥物為主的化療是目前卵巢癌最常用的臨床治療方案，但是多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）的出現(xiàn)往往影響卵巢癌的化療效果，DC-CIK療法是過繼性細(xì)胞免疫療法（adoptive cellular immunotherapy, ACI）之一，有研究表明DC-CIK不僅對(duì)血液腫瘤和多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，還可以增加腫瘤耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，下調(diào)耐藥基因MDR1的表達(dá)。本研究通過

2、體外培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC）聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer, CIK）作用于卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP，觀察DC-CIK對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)耐藥作用及對(duì)耐藥基因MDR1表達(dá)量的影響。
　　方法：
　　1.采集健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），在體外用重組人干擾

3、素-γ（Recombinant Human interferon-γ, rhIFN-γ）、CD3單克隆抗體（CD3 monoclonal antibody, CD3McAb）、重組人白介素-2（Recombinant Human interleukine-2, rhIL-2）、重組人白介素-1α（Recombinant Human interleukine-1α, rhIL-1α）作用下誘導(dǎo)非貼壁細(xì)胞成CIK細(xì)胞，用重組人白介素-4（R

4、ecombinant Human interleukine-4, rhIL-4）、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(Recombinant Human granulocyte-macrophage CSF, rhGM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)作用下誘導(dǎo)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞成DC細(xì)胞。將DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，利用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometr

5、y, FCM）檢測(cè)CIK細(xì)胞的免疫表型CD3+CD56+及DC細(xì)胞免疫表型CD83+、CD86+的表達(dá)情況。
　　2.采用CCK法分別檢測(cè)CIK細(xì)胞和DC-CIK細(xì)胞在效靶比為2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1時(shí)對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞24h的抑制率，計(jì)算出CIK細(xì)胞及DC-CIK細(xì)胞對(duì)SKOV3/DDP作用24h后的非細(xì)胞毒性濃度IC10。
　　3.采用CCK法檢測(cè)順鉑對(duì)不同組靶細(xì)胞SKOV3/DDP的抑制作

6、用，設(shè)順鉑濃度為1 ug/ml、2 ug/ml、4 ug/ml、8 ug/ml、16 ug/ml、32 ug/ml，靶細(xì)胞SKOV3/DDP分為3組，對(duì)照組為SKOV3/DDP組，實(shí)驗(yàn)組1為經(jīng)非細(xì)胞毒性濃度 IC10的CIK干預(yù)后的SKOV3/DDP細(xì)胞組（SKOV3/DDP+CIK），實(shí)驗(yàn)組2為經(jīng)非細(xì)胞毒性濃度IC10的DC-CIK干預(yù)后的SKOV3/DDP細(xì)胞組（SKOV3/DDP+DC-CIK），計(jì)算順鉑對(duì)各組SKOV3/DDP細(xì)

7、胞的半數(shù)抑制濃度IC50，以判斷CIK和DC-CIK細(xì)胞能否增加耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP對(duì)順鉑的敏感性。
　　4.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)SKOV3細(xì)胞組、SKOV3/DDP細(xì)胞組、SKOV3/DDP+CIK細(xì)胞組、SKOV3/DDP+DC-CIK細(xì)胞組的耐藥基因MDR1表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離出PBMC并誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟DC及CIK細(xì)胞，于相差倒置顯微鏡下觀察，可見CIK細(xì)胞大量擴(kuò)增，部分

8、細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，DC細(xì)胞呈現(xiàn)出成熟DC細(xì)胞典型的毛刺樣突起。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)出DC細(xì)胞表面有（55.66±5.13）％表達(dá)成熟DC特異性表面標(biāo)志CD83+，有（91.70±3.09）%表達(dá)CD86+，CIK細(xì)胞的CD3+CD56+雙陽(yáng)性率達(dá)（56.63±6.21）%，提示大部分DC及CIK已成熟；
　　2.在效靶比為2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1作用下，CIK細(xì)胞對(duì)卵巢癌耐藥株 SKOV3/DDP24h的抑

9、制率分別為（4.33±0.31）%、（8.03±0.57）%、（15.60±0.79）%、（22.14±0.61）%、（38.60±0.40）%， DC-CIK細(xì)胞對(duì) SKOV3/DDP的抑制率分別為（5.30±0.26）%、（9.97±0.31）%、（19.67±0.47）%、（32.20±0.58）%、（49.40±0.28）%，結(jié)果顯示隨著效靶比的增加，CIK細(xì)胞及DC-CIK細(xì)胞對(duì)SKOV3/DDP的殺傷力逐漸增強(qiáng)，兩組在2.5

10、:1、5:1時(shí)抑制率與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在10:1、20:1、40:1時(shí)抑制率與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且在同一效靶比下，同源的DC-CIK細(xì)胞比CIK細(xì)胞的殺傷作用大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；通過線性回歸計(jì)算出CIK和DC-CIK對(duì)SKOV3/DDP的IC10分別為7.68:1和5.75:1，根據(jù)文獻(xiàn)，研究某方法或藥物逆耐藥作用時(shí)一般選取略小于IC10的劑量，因此本實(shí)驗(yàn)選取

11、CIK細(xì)胞及DC-CIK細(xì)胞對(duì)SKOV3/DDP作用的效靶比為5:1；
　　3.CCK法檢測(cè)順鉑對(duì)不同組SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制作用，CIK及DC-CIK細(xì)胞效靶比為5:1，聯(lián)合作用于SKOV3/DDP細(xì)胞24h后，算得順鉑對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50由22.33ug/ml分別降至14.31ug/ml、11.39ug/ml，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)分別為1.56倍和1.96倍，增加了SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；
　　

12、4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組靶細(xì)胞中耐藥基因MDR1的表達(dá)水平，2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以卵巢癌非耐藥株SKOV3為對(duì)照組，表達(dá)量為1，耐藥株 SKOV3/DDP的MDR1呈高表達(dá)，表達(dá)量為（21.498±3.744），經(jīng)過CIK細(xì)胞及DC-CIK細(xì)胞作用后，MDR1表達(dá)量均下降，分別為（11.248±3.806）、（7.554±1.821），SKOV3/DDP+DC-CIK細(xì)胞組MDR1下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

13、5）。
　　結(jié)論：
　　1.健康人外周血來源的PBMC經(jīng)過相應(yīng)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)及培養(yǎng)后，可以獲得成熟DC細(xì)胞和大量增殖的CIK細(xì)胞，選用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的免疫表型，鑒定CIK細(xì)胞及DC細(xì)胞方法簡(jiǎn)單、可靠。
　　2.CIK細(xì)胞及DC-CIK細(xì)胞對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP均有殺傷作用，并且在一定范圍內(nèi)，效靶比越大，效應(yīng)細(xì)胞的殺傷力越大；同一效靶比下，與DC共培養(yǎng)后的DC-CIK細(xì)胞比CIK細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng)， DC