miR-129-5p在椎間盤(pán)退變中的作用及其表觀(guān)遺傳調(diào)控研究.pdf

1、椎間盤(pán)退變影響因素眾多,而其細(xì)胞外基質(zhì)的改變,尤其是Ⅱ型膠原的減少和Ⅰ型膠原的增加被認(rèn)為是椎間盤(pán)退變的顯著特點(diǎn)之一。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)microRNA在椎間盤(pán)退變的機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用,針對(duì)退變椎間盤(pán)組織的microRNA芯片檢測(cè)提示miR-129-5p在退變椎間盤(pán)髓核組織中出現(xiàn)異常下調(diào)。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)COL1A1 mRNA(Ⅰ型膠原基因)和ITGA1 mRNA(整合素α1基因)為miR-129-5p的潛在靶基因。椎間盤(pán)退變時(shí)髓核

2、中Ⅰ型膠原增多的分子機(jī)制尚不明確,而整合素α1又是Ⅰ型膠原于髓核細(xì)胞上的受體。miR-129-5p作為同時(shí)調(diào)控配體(Ⅰ型膠原)和受體(整合素α1)的關(guān)鍵分子,在椎間盤(pán)退變進(jìn)程中勢(shì)必發(fā)揮著重要的作用。本研究在明確了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1在退變及正常椎間盤(pán)髓核組織內(nèi)的表達(dá)分布差異后,分別通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 miR-129-5p對(duì) COL1A1及ITGA1的直接調(diào)控作用,通過(guò)體內(nèi)調(diào)控miR-129-5p觀(guān)察其對(duì)退變模型病

3、理進(jìn)程的影響;并且進(jìn)一步驗(yàn)證了 miR-129-5p可能的上游表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。本研究以miR-129-5p作為中心環(huán)節(jié),構(gòu)筑了相對(duì)完整的椎間盤(pán)退變miR-129-5p調(diào)控機(jī)制,在椎間盤(pán)退變領(lǐng)域提出了全新的退變機(jī)制學(xué)說(shuō),并詳細(xì)闡明了其上下游調(diào)控機(jī)制。整個(gè)研究分為以下四個(gè)實(shí)驗(yàn):
　　實(shí)驗(yàn)一人體髓核組織中miR-129-5p及COL1A1、ITGA1表達(dá)量的研究
　　背景及目的:我們前期microRNA芯片檢測(cè)提示miR-12

4、9-5p在退變椎間盤(pán)髓核組織中出現(xiàn)異常下調(diào)。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)COL1A1 mRNA(Ⅰ型膠原基因)和ITGA1 mRNA(整合素α1基因)為miR-129-5p的潛在靶基因,Ⅰ型膠原的增加被認(rèn)為是椎間盤(pán)退變的顯著特點(diǎn)之一,而整合素α1作為Ⅰ型膠原于髓核細(xì)胞上的受體,其在椎間盤(pán)退變進(jìn)程中的作用尚無(wú)報(bào)道。要想探明上述三者在椎間盤(pán)退變進(jìn)程中的作用,本部分實(shí)驗(yàn)首先探索了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1 mRNA及其編碼的蛋白在退

5、變及正常椎間盤(pán)髓核組織的表達(dá)分布差異。
　　方法:收集正常尸體及退變患者的椎間盤(pán)髓核組織,用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)其miR-129-5p、COL1A1及ITGA1 mRNA的表達(dá)豐度差異,用天狼猩紅染色方法觀(guān)察其膠原的分布差異,用 HE染色方法觀(guān)察其病理學(xué)差異,用免疫熒光染色方法和westen blot方法觀(guān)察其Ⅰ型膠原及整合素α1表達(dá)和分布的差異,用熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標(biāo)方法觀(guān)察其miR-129-5p與Ⅰ型膠原及整合素α

6、1的共表達(dá)情況。
　　結(jié)果:天狼猩紅染色結(jié)果提示退變髓核組織Ⅱ型膠原被Ⅰ型膠原取代,椎間盤(pán)髓核組織中miR-129-5p下調(diào),同時(shí)ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白均出現(xiàn)上調(diào),熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標(biāo)結(jié)果提示miR-129-5p陽(yáng)性細(xì)胞Ⅰ型膠原及整合素α1表達(dá)陰性,反之亦然。
　　結(jié)論:在髓核組織中,miR-129-5p的表達(dá)與ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)向調(diào)控趨勢(shì)。

7、　　實(shí)驗(yàn)二 miR-129-5p對(duì)COL1A1、ITGA1表達(dá)調(diào)控的體外研究
　　背景及目的:通過(guò)實(shí)驗(yàn)一我們發(fā)現(xiàn)了在髓核組織中,miR-129-5p的表達(dá)與ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)向調(diào)控趨勢(shì),然而在退變髓核組織中miR-129-5p和COL1A1及ITGA1的表達(dá)差異是由于兩者間的直接作用導(dǎo)致還是通過(guò)某些特定的中間信號(hào)通路導(dǎo)致呢?生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè),COL1A1及 ITGA1 mRNA的3’UTR

8、存在與miR-129-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn),這為我們研究miR-129-5p直接調(diào)控COL1A1及 ITGA1 mRNA提供了理論依據(jù)。本部分實(shí)驗(yàn)旨在探索 miR-129-5p對(duì)COL1A1及ITGA1 mRNA的直接調(diào)控作用,及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法:通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè) miR-129-5p對(duì) ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,用慢病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的髓核細(xì)胞,上調(diào)/下調(diào)其miR-12

9、9-5p的表達(dá),用western blot方法檢測(cè)對(duì)COL1A1及ITGA1的表達(dá)影響;用實(shí)時(shí)定量PCR方法確認(rèn)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2 OS中有miR-129-5p的表達(dá)后,用慢病毒轉(zhuǎn)染MG-63及U-2 OS,上調(diào)/下調(diào)其miR-129-5p的表達(dá)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Trans-well實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞功能學(xué)的影響。
　　結(jié)果:ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR是miR-129-5p的直接作用靶點(diǎn),上調(diào)/下調(diào)miR

10、-129-5p的表達(dá)后,原代培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中COL1A1及ITGA1的表達(dá)呈現(xiàn)出相應(yīng)的下調(diào)/上調(diào)改變。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示上調(diào)miR-129-5p表達(dá)組U-2 OS及MG-63細(xì)胞劃痕愈合速度明顯快于下調(diào)組。Trans-well實(shí)驗(yàn)提示上調(diào)miR-129-5p表達(dá)組U-2 OS及 MG-63細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯上升;下調(diào) miR-129-5p表達(dá)組 U-2 OS及MG-63細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降。
　　結(jié)論:miR-129-5p

11、通過(guò)與其靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,影響靶蛋白CollagenⅠ和Integrinα1的表達(dá),從而引起細(xì)胞功能學(xué)的改變。
　　實(shí)驗(yàn)三 miR-129-5p對(duì)COL1A1、ITGA1表達(dá)調(diào)控的體內(nèi)研究
　　背景及目的:通過(guò)實(shí)驗(yàn)一及實(shí)驗(yàn)二我們確證了miR-129-5p對(duì)其靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,然而體外培養(yǎng)的細(xì)胞成分簡(jiǎn)單,條件可控性好,影響因素單一,與活體條

12、件下椎間盤(pán)組織的細(xì)胞微環(huán)境相差甚遠(yuǎn)。本部分實(shí)驗(yàn)旨在利用C57小鼠椎間盤(pán)退變模型,觀(guān)察體內(nèi)調(diào)控miR-129-5p對(duì)椎間盤(pán)退變病理進(jìn)程的影響。
　　方法:用實(shí)時(shí)定量PCR方法確認(rèn)C57小鼠體內(nèi)miR-129-5p的表達(dá)豐度后,用鼠尾穿刺法造成 C57小鼠椎間盤(pán)退變模型,分別于造模后通過(guò)腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染,上調(diào)或下調(diào)miR-129-5p在椎間盤(pán)的表達(dá),通過(guò)western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3、6、12w個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠椎間盤(pán)CollagenⅠ

13、及Integrinα1的表達(dá)變化,通過(guò)椎間隙高度指數(shù),組織學(xué)評(píng)分,熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標(biāo)方法觀(guān)察各時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)小鼠椎間盤(pán)退變程度的差異。
　　結(jié)果:造模后3、6、12周,CollagenⅠ及Integrinα1的表達(dá)隨著時(shí)間持續(xù)上升,上調(diào)/下調(diào)miR-129-5p可以降低/增加各時(shí)間節(jié)點(diǎn)CollagenⅠ及Integrinα1的表達(dá);上調(diào) miR-129-5p可以時(shí)間節(jié)點(diǎn)椎間隙高度指數(shù)及組織學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于下調(diào)miR-129-

14、5p組及陽(yáng)性對(duì)照組。
　　結(jié)論:miR-129-5p在體內(nèi)試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)椎間盤(pán)退變的保護(hù)作用,下調(diào)miR-129-5p可以使椎間盤(pán)退變程度增加。
　　實(shí)驗(yàn)四 miR-129-5p表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的研究
　　背景及目的:實(shí)驗(yàn)一到實(shí)驗(yàn)三通過(guò)了體外及體內(nèi)驗(yàn)證,闡明了miR-129-5p對(duì)其下游靶基因靶蛋白的調(diào)控機(jī)制。然而其上游的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本部分實(shí)驗(yàn)旨在探索miR-129-5p上游的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:取正常

15、對(duì)照組及退變組髓核組織各5例,針對(duì)miR-129-5p前體miR-129-1及miR-129-2啟動(dòng)子10kb范圍內(nèi)存在的4個(gè)CpG島行甲基化DNA免疫共沉淀-實(shí)時(shí)定量 PCR(MeDIP-PCR)檢測(cè),在體外培養(yǎng)的原代髓核細(xì)胞中,用 DNA甲基化抑制劑5-Aza-2’-deoxycytidine(5Aza-CdR)處理后通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)其對(duì)miR-129-5p及其下游靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA的表達(dá)調(diào)控作用。

16、>　　結(jié)果:定位于miR-129-2 chr11:43596990-43597336及chr11:43602545-43603215的的兩個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化程度在退變椎間盤(pán)中明顯上調(diào)(P<0.05),體外培養(yǎng)的原代髓核細(xì)胞經(jīng)過(guò)5Aza-CdR處理后 miR-129-5p表達(dá)上調(diào),ITGA1和COL1A1 mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:miR-129-5p在椎間盤(pán)退變進(jìn)程中的異常下調(diào)與其前體pre-miR-129-2定位于ch