擬南芥磷轉(zhuǎn)運體蛋白PHT11在細胞質(zhì)膜上的單分子活體動態(tài)研究.pdf

1、磷轉(zhuǎn)運體蛋白PHT1;1作為磷轉(zhuǎn)運體家族的一個重要成員，在調(diào)節(jié)植物對磷的吸收中有重要的生物學意義。研究表明，植物缺磷時促進PHT1;1蛋白在細胞膜上大量積累，而且PHT1;1胞內(nèi)轉(zhuǎn)運受到多種生物學機制的調(diào)控。但是有關(guān)PHT1;1在細胞質(zhì)膜上的動態(tài)行為卻鮮有報道。本文運用可變角度的全內(nèi)反射熒光顯微鏡，同時結(jié)合單顆粒示蹤技術(shù)(SPT)和熒光漂白步數(shù)分析等單分子技術(shù)，在活體狀態(tài)下對不同磷濃度處理的PHT1;1在擬南芥細胞質(zhì)膜上的動態(tài)變化進行了

2、研究。
　　我們將帶有GFP標簽的PHT1;1轉(zhuǎn)基因擬南芥作為實驗材料，通過激光共聚焦顯微鏡檢測顯示，PHT1;1定位在擬南芥幼苗根部的細胞質(zhì)膜。利用全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)對PHT1;1-GFP進行成像發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在低磷處理下PHT1;1在細胞膜上的表達量較高，蛋白密度較大;而在高磷處理下，PHT1;1在細胞膜上的密度變小。
　　通過全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)結(jié)合單顆粒示蹤技術(shù)對正常生長條件下的擬南芥進行分析表明，PHT1;1-G

3、FP在細胞質(zhì)膜上存在4種運動模式，分別是:布朗運動、定向運動、受限運動和混合運動。應(yīng)用Origin軟件對獲得的時問序列圖像經(jīng)過高斯函數(shù)擬合分析PHT1;1在質(zhì)膜上的動力學參數(shù)，包括質(zhì)膜停留時間、擴散系數(shù)、擴散范圍等。結(jié)果表明，與對照相比，低磷處理使PHT1;1在細胞質(zhì)膜上的停留時間延長，而高磷處理使其停留時間變短。在對照條件下，PHT1;1的擴散系數(shù)呈雙峰分布，出現(xiàn)運動較快和運動較慢兩個擬合峰。低磷處理后，PHT1;1擴散較慢的擬合峰消

4、失，而高磷處理下擴散較快和擴散較慢的兩個擬合峰值均小于對照。對擴散范圍的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與對照相比，低磷處理使PHT1;1的擴散范圍減小，而高磷處理使PHT1;1的擴散范圍增加。總之，與對照相比，低磷處理使PHT1;1在細胞膜上的運動速度加快，而高磷處理使其運動減慢。
　　為了分析PHT1;1在質(zhì)膜上的動態(tài)分布與質(zhì)膜微區(qū)的關(guān)系，我們應(yīng)用固醇抽提劑MβCD破壞膜微區(qū)，通過可變角度的全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀測分析PHT1;1在質(zhì)膜上運動的影

5、響。在不同磷濃度處理下，與對照相比，MβCD處理使PHT1;1蛋白的質(zhì)膜停留時間、擴散系數(shù)以及擴散范圍均變大。我們的結(jié)果表明，質(zhì)膜微區(qū)可能參與外源磷處理下磷轉(zhuǎn)運體蛋白在質(zhì)膜上的運動。
　　我們又通過PIF(Progressive Idealization and Filtering)技術(shù)對PHT1;1寡聚化狀態(tài)進行了分析，結(jié)果顯示在不同磷濃度處理下，PHT1;1在細胞質(zhì)膜上主要以單體和二聚體的形式存在，其中單體形式的比例高于二聚體

6、，而且在高磷處理下，二聚體的比例要高于對照。
　　綜上所述，借助高時空分辨率的單分子成像技術(shù)對不同磷濃度處理條件下擬南芥磷轉(zhuǎn)運體蛋白PHT1;1在質(zhì)膜上的動態(tài)進行分析。
　　通過研究發(fā)現(xiàn):
　　(1) PHT1;1主要定位于細胞膜，而且在細胞膜上存在4種運動模式;
　　(2)低磷處理使PHT1;1在細胞質(zhì)膜上的運動速度加快;
　　(3)膜微區(qū)抽提劑MβCD處理，使PHT1;1的動力學參數(shù)比對照（相同溶劑處理