玫瑰孢鏈霉菌擬核結(jié)合蛋白Lsr2的功能研究.pdf

1、背景：Streptomyces roseosporus NRRL15998是禮來公司的研究人員從土耳其亞拉臘山的土壤中分離得到的一株產(chǎn)孢放線菌。因其能產(chǎn)生臨床重要抗生素達(dá)托霉素而受到廣泛重視。達(dá)托霉素是新型脂肽類抗生素中的一種，經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于治療復(fù)雜的皮膚和軟組織感染，以及由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的菌血癥和心內(nèi)膜炎。然而由于S. roseosporus發(fā)酵獲得的達(dá)托霉素產(chǎn)量很低，因此改造玫瑰孢鏈霉菌以提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量至關(guān)重要。

2、r>　　擬核結(jié)合蛋白最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)確定的鏈霉菌中的擬核結(jié)合蛋白主要包括HupA、HupS、sIHF、Crp、DpsA和DpsC，以及BldD等。這些擬核結(jié)合蛋白在鏈霉菌的發(fā)育分化和次級代謝產(chǎn)物合成方面發(fā)揮重要功能，例如hupA和hupS敲除突變株孢子中的擬核增大；sihf突變株存在產(chǎn)孢缺陷，十一烷基靈菌紅素（Red）和放線紫紅素（Act）產(chǎn)量提高；dps突變株孢子中的擬核發(fā)生不規(guī)則壓縮；crp突變株的放線紫紅素、十一烷

3、基靈菌紅素和鈣依賴抗生素（CDA）的產(chǎn)量顯著下降，未知結(jié)構(gòu)的化合物產(chǎn)生；bldD突變株氣生菌絲形成受阻，孢子分化障礙，抗生素產(chǎn)量顯著下降。
　　分枝桿菌的擬核結(jié)合蛋白Lsr2，是H-NS樣DNA橋連蛋白，與H-NS相比序列和結(jié)構(gòu)不相似，但其功能相同，可互補(bǔ)hns的突變。Lsr2通過結(jié)合并橋連DNA，實現(xiàn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，壓縮擬核等功能。通過生物信息學(xué)分析，在S.roseosporus NRRL15998中發(fā)現(xiàn)2個Lsr2蛋白，但其功能

4、未知。根據(jù)分枝桿菌Lsr2的現(xiàn)有研究，推測S.roseosporus NRRL15998的Lsr2參與發(fā)育分化和次級代謝產(chǎn)物的生物合成調(diào)控，研究其調(diào)控機(jī)制，可為改造玫瑰孢鏈霉菌提供重要理論依據(jù)，為提高已有抗生素產(chǎn)量和激活隱性抗生素生物合成基因簇打下基礎(chǔ)。
　　目的：本文旨在探究S.roseosporus NRRL15998中擬核結(jié)合蛋白Lsr2的功能，包括對S.roseosporus發(fā)育分化和次級代謝產(chǎn)物生物合成的影響，為解析Ls

5、r2在鏈霉菌中的作用機(jī)制和提高已有抗生素產(chǎn)量與激活沉默基因簇提供重要的依據(jù)。
　　方法：
　　1.生物信息學(xué)分析S.roseosporus NRRL15998的基因組序列，初步確定基因組中與編碼分枝桿菌擬核結(jié)合蛋白Lsr2對應(yīng)的同源蛋白的基因lsr2和lsr22。
　　2.為探究S.roseosporus NRRL15998中Lsr2和Lsr22的功能，構(gòu)建fosmid文庫。以文庫質(zhì)粒出發(fā)構(gòu)建敲除載體，進(jìn)而構(gòu)建lsr2

6、和lsr22基因敲除株Δlsr2、Δlsr22和Δlsr2/Δlsr22。以pSET152質(zhì)粒出發(fā)，構(gòu)建過表達(dá)載體，進(jìn)而構(gòu)建lsr2和lsr22的遺傳互補(bǔ)株（CM）和過表達(dá)株（OE）。
　　3.為探究Lsr2和Lsr22在發(fā)育分化方面的功能，在不同的培養(yǎng)基和不同鹽離子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，觀察野生型和各突變株的菌絲和孢子的發(fā)育。通過MIDI脂肪酸檢測系統(tǒng)測定敲除株的脂肪酸成分和含量，確定Lsr2對脂肪酸合成和代謝的影響。
　　

7、4.為研究Lsr2和Lsr22對次級代謝產(chǎn)物生物合成的影響，發(fā)酵突變株、互補(bǔ)和過表達(dá)菌株，進(jìn)行藤黃微球菌、銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌的生物活性測定。再利用半定量RT-PCR檢測野生型和敲除株基因簇的表達(dá)，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)分析，探究轉(zhuǎn)錄水平變化。
　　5.為驗證Lsr2和Lsr22的DNA結(jié)合能力，異源表達(dá)蛋白，以基因簇上基因片段為探針，采用EMSA進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果：
　　1.確定并成功克隆了分枝桿菌Ls

8、r2對應(yīng)于S.roseosporus的2個lsr2基因，分別為lsr2(SSGG_02869)和lsr22(SSGG_03199)。
　　2.成功構(gòu)建了S.roseosporus NRRL15998 fosmid文庫，且文庫遺傳穩(wěn)定性和插入片段隨機(jī)性良好。
　　3.利用fosmid文庫構(gòu)建了lsr2敲除載體pFOSlsr2ko，基于pKC1139構(gòu)建了lsr22敲除載體pKC1139-lsr22，同時基于pSET152構(gòu)建了

9、lsr2過表達(dá)載體pSET152Kan-lsr2和lsr22的過表達(dá)載體pSET152-lsr22。接合轉(zhuǎn)移幾個載體到野生型中成功獲得了lsr2和lsr22基因敲除株（Δlsr2和Δlsr22）、遺傳互補(bǔ)株（lsr2CM和lsr22CM）、過表達(dá)株（lsr2OE和lsr22OE）和雙敲除株（Δlsr2/Δlsr22）。
　　4.在幾種不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)野生型和單雙敲除株。Δlsr2在本研究中采用的多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌絲呈紅色且生

10、長延遲，產(chǎn)孢受阻。在不加鈉鹽的AS-I培養(yǎng)基中加入0.25M的其他金屬離子后，敲除株的產(chǎn)孢能力有一定程度的恢復(fù)。Δlsr22不管是菌絲發(fā)育還是次級代謝方面，幾乎沒有發(fā)生表型變化。但兩個基因都敲除后，表型改變的程度大于lsr2單敲除。
　　5.MIDI脂肪酸檢測系統(tǒng)檢測了野生型和單雙敲除株菌體的脂肪酸成分及其含量，與野生型相比，敲除株的脂肪酸成分及其含量沒有顯著變化。
　　6.Δlsr2產(chǎn)生的抑制藤黃微球菌的生物活性物質(zhì)減少，

11、但抑制銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌的生物活性物質(zhì)增多。
　　7.半定量RT-PCR和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，在轉(zhuǎn)錄水平上，lsr2缺失株中52％的生物合成基因簇顯著上調(diào)。
　　8.體外EMSA實驗中，Lsr22不能結(jié)合DNA，但Lsr2能很好的結(jié)合基因簇FR900098、mureidomycin和collismycin中的SSGG_03174、SSGG_02995、SSGG_02995啟動子和SSGG_05697的DNA片段。

12、r>　　結(jié)論：
　　S.roseosporus NRRL15998基因組中存在兩個lsr2基因，分別是lsr2（SSGG_02869）和lsr22（SSGG_03199）。其中Lsr2對S.roseosporus NRRL15998的生長和次級代謝產(chǎn)物生物合成的激活具有重要的影響。lsr2缺失影響了菌絲的發(fā)育和孢子的產(chǎn)生，但不影響脂肪酸的合成和代謝。最重要的是Lsr2負(fù)調(diào)控多個活性化合物的生物合成基因簇的表達(dá)。Lsr22對S.ro