磁分離靶蛋白-配體復(fù)合物快速篩選混合物配體庫(kù)的技術(shù).pdf

1、本論文提出一種基于磁分離靶蛋白-配體復(fù)合物快速篩選混合物配體庫(kù)的技術(shù)，其過(guò)程包括（a）將混合物樣品與適量外源參考配體混合作為用于篩選樣品（pMFS）；（b）啟動(dòng)PMFS中所有配體與固定在納米磁珠上的靶蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合：（c）磁力回收靶蛋白.配體復(fù)合物，提取結(jié)合的配體；（d）定量PMFS和對(duì)應(yīng)結(jié)合配體提取物中每個(gè)可檢測(cè)配體色譜峰面積；（e）如所有必要條件都滿足，則計(jì)算候選配體與參考配體的相對(duì)親和力，否則需優(yōu)化PMFS和/或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合系統(tǒng)的組成直

2、到滿足所有必要條件；（f）確定每個(gè)混合物庫(kù)成分中潛在有價(jià)值配體；（g）確定潛在有價(jià)值配體中的高親和力配體為潛在hit（s）；（h）通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合判斷潛在hit（s）特異性以確認(rèn)hit（s）；否則確定其它潛在有價(jià)值配體的特異性。 用HPLC-MS分析，以生物素衍生物與固定在納米磁珠上鏈親和素為模型，考察此技術(shù)用于測(cè)定平行液相組合合成（PLCS）單一預(yù)期配體混合物、PLCS制備多個(gè)預(yù)期配體混合物、粗天然產(chǎn)物中多個(gè)預(yù)期配體等親和力的可靠

3、性，及鑒定粗天然產(chǎn)物中痕量高親和力配體的可行性。 測(cè)定混合物中單一預(yù)期配體親和力時(shí)，維持競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合體系參考配體結(jié)合率低于10％，逐步增加PMFSs中候選配體量則候選配體結(jié)合率逐步降低，同時(shí)兩種配體的峰面積可大于各自線性響應(yīng)截距絕對(duì)值的5倍，候選配體相對(duì)親和力也逐步降低；當(dāng)二者結(jié)合率都低于10％后相對(duì)親和力達(dá)到下降曲線水平底部的均值可為該配體的相對(duì)親和力。 定量測(cè)定混合物中多個(gè)預(yù)期配體親和力時(shí)，對(duì)純化生物素衍生物的混合物和P

4、LCS制備的多生物素衍生物混合物，只要其中所含候選配體數(shù)量足夠少且含量差異足夠小，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下用HPLC-MS分析能成功篩選出多個(gè)混合物中最高親和力的配體。對(duì)此兩類樣品，其組成決定此方法可靠性。通過(guò)與高親和力參考配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和同變性靶蛋白結(jié)合，可有效同步判斷混合物中多個(gè)候選配體的特異性。 如粗天然產(chǎn)物中候選生物素衍生物間含量差異較小，此技術(shù)也可同步測(cè)定其中有限數(shù)量候選配體的親和力和同步判斷其特異性。以前一輪回收的配體為樣品

5、進(jìn)行下一輪的篩選，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、磁分離后提取結(jié)合配體等過(guò)程的迭代進(jìn)行，理論上可實(shí)現(xiàn)混合物中高親和力配體的指數(shù)富集（EELHA）。用含有多個(gè)不同親和力和不同含量生物素衍生物的川芎甲醇提取液為樣品，證實(shí)該策略有效富集高親和力配體，從而快速發(fā)現(xiàn)混合物中含量?jī)H2％但親和力高三倍的配體。為提高EELHA的效果，相鄰下輪篩選時(shí)靶蛋白量應(yīng)不多于上一輪回收配體總量的20％，但此迭代過(guò)程對(duì)應(yīng)的靶蛋白用量很大。EELHA對(duì)發(fā)現(xiàn)已知藥理活性粗天然產(chǎn)物中的痕量