油菜素內(nèi)酯調(diào)控棉花對黃萎病菌抗性的生理和生化機制.pdf

1、陸地棉作為世界上最主要的栽培棉種，極易感染黃萎病。黃萎病由土傳半寄主性真菌——黃萎病菌(Verticillium dahliae)引起，由于寄主的特異性和宿主的變異性，常規(guī)的栽培措施不能夠有效控制這種疾病。因此，抗性品種的選育已成為一種控制黃萎病蔓延和減少經(jīng)濟損失的有效手段。而要實現(xiàn)這個目標，我們需要很明確的了解真菌病原菌感染及其寄主相應(yīng)的防御響應(yīng)的機制。本文基于這個目的，研究了棉花在黃萎病菌脅迫條件下外源油菜素內(nèi)酯(EBR)減輕黃萎病

2、菌危害的生理和生化反應(yīng)及其可能的機制。主要的研究結(jié)果如下:
　　1.黃萎病菌毒素(Vd toxin)的活性，及其對陸地棉細胞結(jié)構(gòu)、植株形態(tài)和生化特性的影響。
　　用Vd毒素處理棉花根系，對陸地棉5個不同的基因型在細胞/組織水平和生理生化水平上產(chǎn)生很大的影響。Vd毒素能使棉株對營養(yǎng)液(BNS)的吸收能力急劇降低，與對照相比，各個供試品種（系）的吸收值分別降低如下:NIAB-846降低75％，ZhedaB降低70％，Zheda

3、R降低63％，NIAB-111降低56％，NIAB-999降低34％。同樣處理，與其它基因型相比，NIAB-999被Vd毒素誘導后使SOD活性提高， ASA和GSH含量降低，MDA的積累降低。另外，Vd毒素的影響可以持續(xù)兩周，不但影響植株的生長，還會影響根的發(fā)育，具體表現(xiàn)在根表面積、根的長度、根直徑和根體積等指標的減少;而這些指標都與植株吸收BNS的數(shù)值息息相關(guān)。這可能更進一步導致在Vd毒素處理下的植株根尖的受損、葉片氣孔的關(guān)閉、根細胞

4、結(jié)構(gòu)的變異。綜合評分結(jié)果顯示，供試棉花材料對黃萎病菌的抗性依次為NIAB-999＞NIAB-111＞Zheda R＞ZhedaB＞NIAB-846。我們的結(jié)果表明，Vd毒素可以代替黃萎病菌來對植株細胞水平產(chǎn)生脅迫并監(jiān)測黃萎病菌的作用機制。
　　2.油菜素內(nèi)酯(EBR)可以減輕Vd毒素對棉花的毒害，促進棉花愈傷的生長
　　用油菜素內(nèi)酯(EBR)處理棉花愈傷（浙大B）可以減輕Vd毒素對棉花的毒害，產(chǎn)生抗性，促進愈傷生長。先用EB

5、R處理愈傷（EBR預(yù)處理）所產(chǎn)生的對Vd毒素的抗性比共處理（將EBR加入含毒素的愈傷培養(yǎng)基中）的效果要好的多。預(yù)先用EBR處理過的愈傷，在Vd毒素作用下依然保持綠色;而EBR與Vd共處理、Vd單獨處理，棉花愈傷的褐化率分別為65％和90％。同樣的，預(yù)EBR處理后愈傷的鮮重比Vd單獨處理下愈傷鮮重增重52％，而共處理后愈傷的鮮重僅增重23％。實驗結(jié)果還表明，與Vd毒素處理的愈傷相比，用EBR處理后棉花愈傷中葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素、多

6、酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、莽草酸脫氫酶(SKDH)、總酚、類黃酮、可溶性糖和蛋白質(zhì)的含量或活性均有所升高。而且，EBR預(yù)處理的愈傷在這些指標上增加的量要高于共處理的愈傷組織。EBR處理的愈傷中DNA斷裂的情況要明顯的輕于Vd毒素處理下的愈傷組織。進一步研究表明，EBR處理愈傷組織中線粒體的數(shù)量/結(jié)構(gòu)，以及基粒和基質(zhì)類囊體也有所改進。EBR處理愈傷組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體的聯(lián)系更緊密。上述結(jié)果還表明

7、，EBR誘導棉花愈傷對Vd毒素的抗性主要是通過保護光合機構(gòu)，提高光合色素和調(diào)節(jié)次生代謝來實現(xiàn)的。
　　3.油菜素內(nèi)酯(EBR)通過調(diào)節(jié)碳水化合物的代謝、細胞膜ATP酶和細胞滲透性來抑制陸地棉黃萎病的發(fā)生
　　在前面研究的基礎(chǔ)上，我們將我們的研究擴展到整個棉花植株，監(jiān)測棉花在兩種處理(Vd毒素單獨處理，Vd毒素+EBR處理)時黃萎病的發(fā)病機制，以及EBR減輕棉花對Vd毒素損害的作用;其中，處理根系時的EBR濃度為5、10和15

8、nM，處理葉片時的EBR濃度為50、100和200 nM。研究結(jié)果表明，在沒有EBR的處理中，毒素引起棉株的萎蔫率為83％，根部甘氨酸甜菜堿和脯氨酸的積累分別比對照組（未加毒素）增加33％和61％。然而，在EBR處理的棉株中，這些物質(zhì)的積累降低至5 nM和200 nM。而且，結(jié)果顯示，Vd毒素單獨處理使棉株的可溶性糖含量、光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、葉綠素含量和葉綠素熒光（Fv/Fm）比Vd毒素+EBR的處理顯著下降。此外，與V

9、d毒素單獨處理的棉株相比，Vd毒素+EBR處理棉株使蔗糖合成酶的活性(SuSy)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)均有升高，同時伴隨著棉株根和地上部生物量的增加。還發(fā)現(xiàn)，與Vd毒素處理相比，EBR處理可以提高棉株總ATP酶、Na+ K+-ATP酶的活性，以及降低Ca+2 Mg+2-ATP酶和H+K+-ATP酶的活性。本研究可以增加對黃萎病的認識，以及對EBR誘導棉株對Vd毒素抗性的潛在作用有所了解。
　　4.不同基因型棉

10、花對黃萎病抗性和油菜素內(nèi)酯誘導抗性的生理生化特征
　　用溫室實驗的方法，觀察了陸地棉（易感）、海島棉（抗病）和及其雜種（耐?。d毒素的反應(yīng)，以及EBR處理的作用。結(jié)果表明，與陸地棉比較，海島棉和海陸雜種棉株表現(xiàn)為:超氧化物（O2-）積累低，滲透勢(OP)增加，水含量(RWC)增加，PAL、PPO和SKDH活性受抑制較輕，可溶性蛋白含量、胼胝質(zhì)和DPPH自由基含量較高，酚類和黃酮類化合物含量減少。而且，這兩個基因型具有較低的活性

11、氧清除酶活性，表明它們比陸地棉有較適度的氧化脅迫。進一步研究表明，EBR可通過增強滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除和解毒的信號來增強植株抗性。例如，在Vd毒素+EBR處理的所有基因型棉株中，AI活性均很高，因此使植株的滲透勢增加，從而使受感染的植物葉片相對含水量保持在較高水平。此外，EBR的應(yīng)用可以增加葉片細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)，脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性，從而能降低活性氧含量

12、，促進棉花葉片的解毒過程。
　　5.不同基因型棉花根在碳水化合物、次生代謝產(chǎn)物、抗氧化能力，及其根分泌物的氨基酸含量上的差異
　　Vd毒素處理使棉花根的氧化加劇，SuSy、SPS、A1、DPPH和脫氫酶活性急劇降低，谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)和超氧化物歧化酶的活性升高，谷胱甘肽、抗壞血酸、PAL、SKDH、黃酮類化合物和脂質(zhì)過氧化的增加。相反，EBR可以增加根系脫氫酶活性，降低O2-和H2O2、MD

13、A和總黃酮的積累，以及降低DPPH和GR的活性。此外，陸地棉中活性氧積累量和MDA含量顯著高于其它兩種基因型（海島棉和海陸雜種），而根系脫氫酶活性顯著低于其它兩個基因型。同樣，AI、SuSy和SPS的活性在海陸雜種中保持不變，而在另外兩個基因型中均有所降低，其中陸地棉的降幅最大。Vd毒素也增加了在所有品種的PAL和SKDH活性，而EBR處理后只有抗性和耐性基因型中PAL和SKDH活性進一步增加。有趣的是，CAD活性在海島棉中要顯著高于其

14、它兩種基因型，胼胝質(zhì)的增量也顯著高于其他兩種基因型。同樣，Vd毒素處理激發(fā)了所有基因型的GR、GPX、SOD、GST和DHAR活性提高，并以海島棉的增幅最大，海陸雜種在GSH和ASA含量上的增幅次之。進一步研究表明，黃萎病菌孢子暴露于棉花根系使得根分泌物中的蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)和絲氨酸(Ser)含量在所有基因型中都有所增加，而EBR處理使他們的含量進一步提高。此外，與陸地棉相比，海島棉和海陸雜種根組織中的黃酮類含量，根分泌

15、物中的酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phe)含量均有所提高，而這些變化的結(jié)果均能顯著降低真菌的生長。因此，研究認為EBR處理對棉花根系影響不大，而誘導抗性的水平主要與基因型差異有關(guān)。6.液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析表明植株酚類化合物和內(nèi)源植物激素有助于油菜素內(nèi)酯誘導棉花抗病
　　PAL和CAD酶動力學及其轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果顯示，用黃萎病菌單獨處理的棉株，其活性和轉(zhuǎn)錄水平有更早和更多的增加;相反，在Vd毒素+EB

16、R處理的植株中，這兩個指標隨著時間推移而逐步降低。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)的甲醇提取物結(jié)果顯示，苯甲酸、肉桂酸和羥基苯甲酸能在葉片組織和Vd毒素中檢測到，而鄰苯二甲酸、4-羥基肉桂酸、沒食子酸和香草酸只能在葉片組織中檢測到。此外，棉花黃萎病菌接種處理，以及EBR單獨處理或者與EBR組合(Vd毒素+EBR)處理，均會使酚類化合物的含量顯著變化。在棉花被病菌感染的早期階段，苯甲酸、間羥基苯甲酸、肉桂酸含量的降低，以及鄰苯二甲酸和4-羥基

17、肉桂酸的積累均表明，黃萎病菌單獨處理對棉株的影響比EBR+黃萎病菌組合處理的影響要大。研究結(jié)果顯示，黃萎病菌接種和EBR處理棉花均會影響植物內(nèi)源激素水平。在黃萎病菌單獨處理下，吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)的含量先出現(xiàn)下降，之后升增加。相反，在黃萎病菌接種和隨之的EBR處理棉花時，脫落酸(ABA)和赤霉素(GA3)含量不斷增加。此外，分別參與SA、ABA和JA的合成的NPR1，DREB2B和LOX1的表達量在棉花黃萎