L-Ser對擬南芥和浮萍生長發(fā)育的影響及其代謝途徑關鍵酶SGAT的研究.pdf

1、L-絲氨酸(L-Ser)是植物進行蛋白質(zhì)合成所必需的氨基酸之一，也是植物細胞中多種重要物質(zhì)合成的前體。因此，L-Ser的缺失能導致植物的生長發(fā)育出現(xiàn)異常，例如擬南芥的絲氨酸缺失突變體表現(xiàn)出根部生長受阻，花粉發(fā)育異常以及對激素ABA不敏感等。L-Ser可能還具有衰老信號的作用，例如實驗室前期工作表明，用外源L-Ser處理紫萍(Spirodela polyrrhiza P143)完整植株或半葉狀體，當使其體內(nèi)濃度達到或超過一定的閾值時即能導

2、致它們的衰老和死亡。
　　為了深入了解植物體內(nèi)“超量”L-Ser在植物生長發(fā)育中的重要作用及其作用機制，本研究以雙子葉植物擬南芥(Arabidopsis)和單子葉植物浮萍(Lemnaminor)為材料，在發(fā)現(xiàn)外源L-Ser處理兩種植物能夠?qū)е缕涑霈F(xiàn)前人尚未報道的生長現(xiàn)象的基礎上，首先對“超量”L-Ser抑制擬南芥主根生長發(fā)育、促進側(cè)根生長的機制進行了研究，然后對L-Ser在光呼吸途徑中的轉(zhuǎn)化酶------絲氨酸:乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(

3、SGAT)在擬南芥中的編碼基因AtAGT1進行了遺傳操作------一方面進行了過表達，另一方面通過RNAi技術進行了敲減表達，以此改變轉(zhuǎn)基因植物的內(nèi)源L-Ser水平，在驗證外源L-Ser的作用的同時，揭示AtAGT1基因可能具有的除光呼吸途徑以外的新功能。與此相關，我們還通過在其啟動子上連接GUS報告基因，對AtAGT1基因的表達特異性進行了分析。最后，為進一步研究L-Ser在擬南芥根生長發(fā)育中調(diào)節(jié)作用的分子機制，構建了根中L-Ser

4、合成的主要代謝途徑的3個酶（3-磷酸絲氨酸磷酸酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶和3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）編碼基因的過表達載體，目前已經(jīng)獲得了部分遺傳轉(zhuǎn)化株系。研究取得的主要結果如下:
　　1.對25天苗齡的擬南芥分別進行1 mM L-Ser、1 mM L-Trp（對照）和水的噴施實驗，每天噴施一次，噴施10天后，噴施1 mM L-Ser的擬南芥葉片出現(xiàn)了明顯的黃化和局部壞死用，而對照則沒有，說明（超過）一定濃度的絲氨酸對擬南芥葉片有促進

5、衰老作用;在培養(yǎng)基中添加不低于1 mM的外源L-Ser能夠抑制擬南芥主根的生長，促進側(cè)根的生成。隨著L-Ser濃度的升高，主根根長受抑制程度也不斷增加。2 mM L-Ser處理擬南芥7d后，主根根長僅為正常情況下的1/4左右。內(nèi)源L-Ser含量測定結果表明，培養(yǎng)基中添加外源L-Ser處理引起了內(nèi)源L-Ser含量的變化，例如在外施濃度為1.5 mM時，地下部內(nèi)源L-Ser含量可增加到對照組的4.5倍左右。利用培養(yǎng)基中添加L-Ser的方法處

6、理擬南芥生長素報告株系DR5∶GUS，發(fā)現(xiàn)主根和根尖部位生長素的響應至少從處理后的第2天就開始增強，側(cè)根生長素的響應也出現(xiàn)明顯的變化，6天以后與未加L-Ser的對照相比，差異已非常明顯?；虮磉_水平檢測結果表明，L-Ser導致了生長素輸入載體基因AUX1和衰老相關基因SAG12的表達上調(diào)，而代謝L-Ser的SGAT編碼基因AtAGT1表達的下調(diào)。
　　2.用L-Ser處理浮萍愈傷組織，結果發(fā)現(xiàn)能提高其再生能力。除L-Ser外，在測

7、試過的所有20種蛋白質(zhì)合成前體氨基酸中，L-Gly和L-Cys對浮萍的再生也有促進作用，但明顯小于L-Ser。在植物體內(nèi)，L-Ser和L-Gly之間可以很容易互相轉(zhuǎn)化，檢測發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中添加L-Gly后，愈傷組織內(nèi)源甘氨酸含量在早期出現(xiàn)小幅上調(diào)，而絲氨酸的含量卻大幅增加，暗示吸收的L-Gly大部分可能轉(zhuǎn)化為了L-Ser，可能由此促進了浮萍愈傷組織的再生。L-Ser是L-Cys合成的前體，因此推測其促進再生的原因可能在于半胱氨酸的吸收導

8、致了內(nèi)源絲氨酸向半胱氨酸轉(zhuǎn)化的減少，一定程度上引起內(nèi)源絲氨酸含量的增加。在添加1.0 mML-Ser的再生培養(yǎng)上，再生率在第11天和14天時已分別達到46％和87％，為已報道的浮萍愈傷組織再生的最快速度，這也是最適合浮萍愈傷組織再生的L-Ser濃度，而L-Gly的最適濃度為1.5 mM。
　　3.在浮萍中過表達擬南芥的AtAGT1基因，轉(zhuǎn)基因浮萍中SGAT酶活性升高，L-Ser含量降低。雖然在正常生長條件下并未觀察到浮萍的表型變化

9、，然而在鹽脅迫下，AtAGT1過表達浮萍的抗鹽性增強，與野生型相比轉(zhuǎn)基因浮萍根部斷裂減少，斷根的數(shù)目只有對照的約1/3;與此同時光系統(tǒng)Ⅱ的最大量子產(chǎn)額的下降得到延緩，MDA的含量的增加較少，ROS積累減少，抗氧化系統(tǒng)增強。鹽脅迫處理后，AtAGT1過表達轉(zhuǎn)基因浮萍和野生型浮萍SGAT酶活都隨著鹽濃度的升高(100 mM～300 mM)先上升后下降，但轉(zhuǎn)基因浮萍SGAT酶活性始終高于野生型;24h鹽脅迫處理引起了野生型浮萍L-Ser含量隨

10、鹽濃度的升高呈線性增長的趨勢，轉(zhuǎn)基因浮萍的L-Ser含量則為先上升后下降，并顯著低于野生型。AtAGT1過表達引起轉(zhuǎn)基因浮萍抗鹽性的增強表明光呼吸途徑通過ROS和抗氧化系統(tǒng)參與了抗鹽脅迫。
　　4.利用RNAi技術對擬南芥AtAGT1進行的敲減研究結果表明，AtAGT1-RNAi轉(zhuǎn)基因株系中L-Ser含量顯著高于野生型，轉(zhuǎn)基因植株矮小，根長變短，葉片出現(xiàn)萎黃斑點。轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率下降，葉綠素光譜掃描實驗表明其光合色素尤其是葉

11、綠素a和葉綠素b的含量均比野生型明顯下降，但出現(xiàn)了一定程度的葉黃素積累。
　　5.為了研究擬南芥AtAGT1基因可能在根中的表達及其生理功能，首先對其啟動子進行了生物信息學分析，結果發(fā)現(xiàn)AtAGT1啟動子具有脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA)和水楊酸(SA)等的響應順式作用元件和根部特異性元件，暗示AtAGT1基因的表達可能響應多種激素信號并在根部具有表達。因此，我們構建了AtAGT1∶GUS載體，并獲得了多