泥鰍發(fā)育不同時(shí)期性腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及Wnt4基因的生物信息學(xué)分析.pdf

1、泥鰍屬于鯉形目，鰍科，花鰍亞科，泥鰍屬，廣泛分布于中國，日本，韓國，俄羅斯和印度等地。它被稱為“水中人參”，是一種高營養(yǎng)價(jià)值的魚。此外，泥鰍是中國經(jīng)濟(jì)重要的養(yǎng)殖魚類?？刂坪凸芾砟圉q的繁殖是在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)中獲得這種魚的可持續(xù)供應(yīng)的必要步驟。因此，對(duì)該物種性腺發(fā)育和配子形成的分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用石蠟切片對(duì)泥鰍性腺發(fā)育時(shí)期進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，從而確定泥鰍性腺的幾個(gè)關(guān)鍵

2、發(fā)育時(shí)期分別是原始生殖細(xì)胞(PGC)，Ⅱ期精巢(T2)，Ⅱ期卵巢(O2)，成熟精巢(TA)和成熟卵巢(OA)。⑵使用Illumina測序技術(shù)對(duì)以上性腺發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行從頭轉(zhuǎn)錄組裝配和基因表達(dá)分析。Illumina測序共產(chǎn)生321050936個(gè)raw reads。在去除銜接子序列，不明確的核苷酸和低質(zhì)量序列后，仍有315776696個(gè)clean reads。與Nr，Nt，Swiss-Prot，KEGG，GO，KOG和Pfam七個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行

3、比對(duì)，至少與一個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)成功注釋的有68718個(gè)unigenes(48.15％)，與所有七個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)成功的有10813個(gè)unigenes(7.57％)。此外，為原始生殖細(xì)胞(PGC)，Ⅱ期精巢(T2)，Ⅱ期卵巢(O2)，成熟精巢(TA)和成熟卵巢(OA)構(gòu)建了5個(gè)數(shù)字基因表達(dá)庫(DGE)，還鑒定了五個(gè)樣品中許多基因的特異性表達(dá)。在5個(gè)文庫中選擇具有高差異表達(dá)的一些基因作為與性腺發(fā)育相關(guān)的候選物。⑶通過qRT-PCR與Illumina

4、測序數(shù)據(jù)文庫中的FPKM值相互驗(yàn)證得到，qPCR表達(dá)結(jié)果與從Illumina測序數(shù)據(jù)文庫獲得的結(jié)果大部分的表達(dá)趨勢都是一樣的。這也證明測得的五個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)是可靠及準(zhǔn)確的，可以為以后的實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。⑷根據(jù)已經(jīng)得到的文庫數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，并且參考其它硬骨魚類的Wnt4基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，結(jié)合PCR克隆技術(shù)，得到了泥鰍該基因的全長序列。結(jié)果表明，其中5'非翻譯區(qū)（5'-UTR）429 bp，3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)包含polyA尾共1

5、092 bp，開放閱讀框1056bp，編碼351個(gè)氨基酸。用ProtParam分析分子量為39181道爾頓，理論等電點(diǎn)為8.68，共20種氨基酸，有22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，有跨膜區(qū)。對(duì)泥鰍WNT4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)α螺旋占比32.39％，β轉(zhuǎn)角占比8.24％，無規(guī)卷曲占比39.77％，延伸鏈占比19.6％。氨基酸序列與硬骨魚類中保守性較高，而與兩棲類、鳥類、哺乳類動(dòng)物間保守性較低。泥鰍與同為鯉形目的模式生物斑馬魚的該基因間的