毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測赤潮毒素及DNA錯配分析.pdf

1、本工作將毛細(xì)管電泳電化學(xué)方法和酶聯(lián)免疫分析相結(jié)合,以HRP為標(biāo)記酶,選擇高靈敏度的供氫體為底物,酶催化反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后用微電極進(jìn)行安培檢測,實現(xiàn)了麻痹性貝毒(PSP)、腹瀉性貝毒(DSP)和記憶缺失性貝毒(ASP)三種赤潮毒素的快速在線檢測,檢測時間由常規(guī)免疫分析1 d以上縮短至幾分鐘,操作簡便,試劑消耗量少,可滿足現(xiàn)場檢測要求。利用金屬離子Hg2+與Ag+分別可以結(jié)合DNA雙鏈中的兩個T堿基與C堿基的性質(zhì),以二茂鐵與Tris

2、-HCl溶液為體系,實現(xiàn)了DNA單堿基錯配的識別,并考察了不同錯配位點的電泳分離度。全文共分為六章。
　　 第一章為緒論,簡要地介紹了毛細(xì)管電泳技術(shù)的現(xiàn)況與前景,毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶催化分析以及赤潮毒素的研究進(jìn)展,并說明了本課題的意義及主要內(nèi)容。
　　 第二章利用毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析檢測辣根過氧化物酶(HRP)。HRP催化H2O2氧化鄰氨基酚(OAP)生成3-氨基吩嗯嗪(AP),AP在一定條件下發(fā)生氧還反應(yīng)。通過電

3、化學(xué)檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物AP間接檢測HRP的含量。對HRP的最佳檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化,最后確定分離高壓為15 kv,進(jìn)樣高壓與進(jìn)樣時間分別是10 kv和6 s,緩沖溶液是pH=5.0濃度為1.0×10-2 mol·L-1的BR溶液。在此狀態(tài)下,游離HRP檢測限為1.09×10-12 mol·L-1(S/N=3),線性范圍為2.3×10-12_3.5×10-10 mol·L-1。
　　 第三章通過競爭模式分離了麻痹性貝毒(PSP)和腹瀉

4、型貝毒(DSP)這兩種赤潮毒素。實驗中,將一系列不同濃度的PSP抗原標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)嶋H樣品(Ag)分別和定量的抗OA抗體、酶標(biāo)抗原Ag*加入微富集管孵育過程中,酶標(biāo)抗原Ag*與標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)嶋H樣品中的抗原同限量的抗體發(fā)生競爭反應(yīng),然后進(jìn)樣到毛細(xì)管中進(jìn)行分離,過量的Ag*和免疫復(fù)合物[Ab-Ag*]依次到達(dá)酶促反應(yīng)池后開始催化H2O2氧化底物的反應(yīng),從而在Pt電極上得到檢測,可檢測到兩個電泳峰。該方法對PSP測定的線性范圍為0.8～16.0 pg/

5、mL,檢測限為0.32 pg/mL,比酶聯(lián)免疫吸附測定光度法(ELISA)法低5倍;對DSP測定的線性范圍為1.0～50.0 pg/mL,檢測限為0.40pg/mL。用所建立的方法對毒素感染貝類樣品進(jìn)行了測定,并與ELISA法進(jìn)行了對照,二者相關(guān)性很好。
　　 第四章采用非競爭模式,HRP標(biāo)記的記憶缺失性貝類毒素(ASP)抗體(Ab*)過量,樣品溶液在孵育后既含有HRP標(biāo)記的遺忘性貝類毒素抗體-抗原結(jié)合物[Ag-Ab*],又含有

6、未反應(yīng)的遺忘性貝類毒素抗體(Ab*),混合液中的遺忘性貝類毒素-酶標(biāo)抗體復(fù)合物和剩余酶標(biāo)遺忘性貝類毒素抗體根據(jù)遷移速率不同在分離毛細(xì)管中分成不同的區(qū)帶并順次進(jìn)入反應(yīng)毛細(xì)管中,經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后,分別在反應(yīng)毛細(xì)管中催化緩沖液中的過氧化氫氧化底物鄰氨基酚,生成具有電化學(xué)活性的物質(zhì)3-氨基吩嗯嗪,進(jìn)入電化學(xué)檢測池進(jìn)行檢測,可檢測到兩個電泳峰。遺忘性貝類毒素的濃度不同,形成的遺忘性貝類毒素抗原抗體結(jié)合物的量不同,催化過氧化氫氧化鄰氨基酚生成氧化

7、產(chǎn)物3-氨基吩嗯嗪的濃度就不同,產(chǎn)生不同的電化學(xué)信號,由此可對酶標(biāo)遺忘性貝類毒素.抗體復(fù)合物以及貝類樣品中的遺忘性貝類毒素進(jìn)行定量分析。利用非競爭模式分離了記憶缺失性貝毒(ASP),該方法對ASP測定的線性范圍為5.0～500.0 pg/mL,檢測限為.2.0 pg/mL。
　　 第五章將毛細(xì)管電泳與電化學(xué)分析相結(jié)合,實現(xiàn)了DNA單堿基錯配的識別,并考察了不同錯配位點的電泳分離度。利用金屬離子Hg2+與Ag+分別可以結(jié)合DNA雙

8、鏈中的兩個T堿基與C堿基的性質(zhì),當(dāng)有Hg2+存在時,可以形成T-Hg2+-T相互作用;當(dāng)有Ag+存在時,可以形成C-Ag+-C相互作用,從而實現(xiàn)單堿基T或者C錯配DNA的檢測。以二茂鐵標(biāo)記物,標(biāo)記在ssDNA探針上,與靶DNA雜交,生成雙鏈DNA(dsDNA),通過二茂鐵的電化學(xué)性質(zhì)應(yīng)用于檢測錯配DNA。
　　 第六章將毛細(xì)管電泳與電化學(xué)發(fā)光相結(jié)合,初步探討了將Ru(bpy)32+CE-ECL技術(shù)用于錯配DNA的檢測,以Ru(b

9、py)2(dcbpy)NHS為標(biāo)記物,標(biāo)記在ssDNA探針上,與靶DNA雜交,生成雙鏈DNA(dsDNA),通過實驗,得出運(yùn)用0.02mol·L-1 pH為7.0的:PBS(含三丙胺濃度為0.02 mol·L-1)緩沖液,8 kV作為分離電壓,10 kv和10 s作為進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時間,1.1 v作為檢測電勢,900 v作為光電倍增管高壓,采取較好的避光條件,可以對錯配DNA進(jìn)行較好的分離檢測。檢測單堿基錯配的ssDNA的線性范圍為4.