DNA化學(xué)損傷機(jī)制的理論研究.pdf

1、除少數(shù)RNA病毒外，DNA幾乎是所有生物遺傳信息的載體。在生物體內(nèi)，DNA分子結(jié)構(gòu)在生命活動(dòng)的過(guò)程中基本保持不變，這是細(xì)胞乃至整個(gè)生物體生命得以維系、各種生命特征得以傳承的根本保障。但是，DNA分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也不是絕對(duì)的，生物體內(nèi)部及外部環(huán)境的很多物理和化學(xué)因素均可能造成DNA分子結(jié)構(gòu)的異常變化，這就是DNA的損傷。原則上，DNA分子結(jié)構(gòu)的任何異常變化均稱為DNA損傷，包括DNA雙螺旋的非正常解鏈、鏈的斷裂與交聯(lián)、嵌合劑在雙鏈間的插入

2、、堿基的異構(gòu)化與脫落、非正常堿基的摻入、堿基上的化學(xué)修飾以及由此引起的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等等。為保證機(jī)體生理活動(dòng)的正常進(jìn)行、生命過(guò)程的延續(xù)和遺傳的穩(wěn)定性，生物體內(nèi)形成了一整套相當(dāng)完善的修復(fù)系統(tǒng)，可使DNA的損傷得到最大限度的修復(fù)。生物體內(nèi)未被修復(fù)的DNA損傷是極少量的，但就是這些極少量未被修復(fù)的DNA損傷卻可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生非常重大的影響。如果發(fā)生在復(fù)制過(guò)程中，DNA損傷有可能傳給子代，導(dǎo)致基因突變，造成遺傳性疾病或物種的變異：

3、如果發(fā)生在端粒DNA上，則會(huì)影響端粒DNA的生理功能；如果發(fā)生在DNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，就會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤編碼的RNA，進(jìn)而影響翻譯過(guò)程，導(dǎo)致無(wú)法合成具有正常功能的蛋白質(zhì)。DNA損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的老化、惡變或死亡，從而造成生物體的衰老、腫瘤及其他與基因相關(guān)的疾病?；蛲蛔儗?duì)生物也不是完全有害的，一些對(duì)生物有利的突變可能被生物保留下來(lái)，最終導(dǎo)致生物的進(jìn)化。從這個(gè)意義上說(shuō)，DNA損傷亦是生物進(jìn)化的必要條件。DNA的人工損傷(人工誘變)是治療癌癥及遺傳性

4、疾病的重要手段；隨著基因工程的發(fā)展，DNA人工誘變?cè)絹?lái)越多的被用來(lái)改良甚至創(chuàng)造物種。 大多數(shù)DNA損傷是由化學(xué)因素造成的，從本質(zhì)上說(shuō)DNA損傷是一種化學(xué)過(guò)程。利用化學(xué)的理論或?qū)嶒?yàn)方法對(duì)DNA損傷進(jìn)行研究，探明其發(fā)生、發(fā)展的微觀機(jī)制，可以為抑制不良損傷和利用、開(kāi)發(fā)有利損傷奠定基礎(chǔ)并提供理論指導(dǎo)，這在化學(xué)以及生命科學(xué)領(lǐng)域均是具有重大理論和實(shí)際意義的研究課題。實(shí)驗(yàn)上可以檢測(cè)DNA損傷，但由于損傷的比例極小且生理環(huán)境復(fù)雜，通過(guò)實(shí)驗(yàn)方

5、法在分子水平上研究損傷的機(jī)制還很困難。利用理論方法研究DNA損傷的機(jī)制是目前最可行和最重要的手段。本文利用密度泛函理論方法(DFT)對(duì)堿基異構(gòu)化、水解脫氨和氧化脫氨造成的DNA損傷機(jī)制進(jìn)行了理論研究，找到了過(guò)程的過(guò)渡態(tài)和最低反應(yīng)途徑，討論了過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，獲得了一些有意義的結(jié)果。 1．計(jì)算模型的建立 由于計(jì)算方法和計(jì)算機(jī)發(fā)展水平的制約，對(duì)DNA等大分子的理論研究必須進(jìn)行模型化處理。我們對(duì)四種計(jì)算模型進(jìn)行了研究

6、，結(jié)果表明，截?cái)嗵擒真I并用H飽和，即選擇自由堿基模型完全可以滿足堿基損傷過(guò)程研究的要求，延后截?cái)?相當(dāng)于擴(kuò)大糖苷鍵的飽和基團(tuán))對(duì)于計(jì)算結(jié)果的進(jìn)一步改善沒(méi)有明顯作用。這也同時(shí)說(shuō)明，脫氧核糖基團(tuán)的給、吸電子能力大體與氫相當(dāng)。 2．計(jì)算方法的選擇 為了考察計(jì)算方法對(duì)計(jì)算結(jié)果的影響，我們分別用HF、B3LYP和MP2方法在6-3l+G<'*>木水平上對(duì)了DNA堿基異構(gòu)體進(jìn)行了優(yōu)化計(jì)算。結(jié)果表明，HF方法給出的能量最高，MP2方法

7、得到的能量次之，B3LYP方法給出的能量最低。用B3LYP和MP2方法優(yōu)化得到的胞嘧啶鍵長(zhǎng)數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)值比較接近。MP2和B3LYP方法均考慮了電子相關(guān)能，這對(duì)研究具有共軛體系的堿基是必要的，但MP2方法耗時(shí)較多，又不能給出更好的結(jié)果，因此在實(shí)際計(jì)算中，我們均利用B3LYP方法在6-31+G<'*>水平上進(jìn)行優(yōu)化計(jì)算。為了獲得更好的能量精度，在優(yōu)化的基礎(chǔ)上利用6-311+G<,**>基組做單點(diǎn)能計(jì)算并考慮零點(diǎn)能校正。 3．堿基的異

8、構(gòu)化損傷 對(duì)DNA堿基異構(gòu)化過(guò)程的研究結(jié)果表明，所有異構(gòu)化過(guò)程可分為兩大類：一類為原子間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程，另一類為亞氨基上的質(zhì)子擺動(dòng)過(guò)程。這些異構(gòu)化過(guò)程均存在過(guò)渡態(tài)，它們的Hessian矩陣只有一個(gè)負(fù)本征值，對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)正振動(dòng)具有惟一的虛頻率，IRC解析結(jié)果證明這些過(guò)渡態(tài)分屬于各自的最低反應(yīng)途徑。原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程的過(guò)渡態(tài)包含一個(gè)四元環(huán)，質(zhì)子通過(guò)此四元環(huán)發(fā)生原子間轉(zhuǎn)移。該四元環(huán)為平面結(jié)構(gòu)并且與堿基骨架共平面；亞氨基上質(zhì)子擺動(dòng)過(guò)程的過(guò)渡

9、態(tài)關(guān)鍵部分是由亞氨基與直接相連的碳原子構(gòu)成的三元結(jié)構(gòu)。在原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移的過(guò)渡態(tài)中，伴隨著新鍵的形成和舊鍵的斷裂，原子間發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移，使得整個(gè)分子的電荷出現(xiàn)了重新分布，相鄰原子間的鍵長(zhǎng)也發(fā)生了明顯變化。在亞氨基質(zhì)子擺動(dòng)過(guò)程的過(guò)渡態(tài)中，直接涉及的兩個(gè)化學(xué)鍵均被削弱，同樣存在電荷轉(zhuǎn)移以及由此造成的電荷重新分布；質(zhì)子擺動(dòng)過(guò)程沒(méi)有凈的化學(xué)鍵形成與斷裂，屬于幾何異構(gòu)過(guò)程。直接導(dǎo)致DNA正常構(gòu)型變化(DNA損傷)的異構(gòu)化過(guò)程為堿基酮式與烯醇式之間的

10、變化或氨基與亞氨基之間的轉(zhuǎn)變，它們均屬于原子間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過(guò)程。它們的反應(yīng)勢(shì)壘大于140KJ/mol，常溫下其反應(yīng)速率常數(shù)小于10<'-10>/S，說(shuō)明堿基的異構(gòu)化是一個(gè)比較緩慢的過(guò)程。過(guò)渡態(tài)的虛頻數(shù)值表明原子間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程具有較大的隧道效應(yīng)。其它原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程不直接導(dǎo)致DNA損傷，但其性質(zhì)和行為與上述過(guò)程大體類似。亞氨基質(zhì)子擺動(dòng)過(guò)程與原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程具有明顯不同的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。它們的反應(yīng)勢(shì)壘約在100KJ/mol左右，速率常數(shù)

11、較大，隧道效應(yīng)較小。熱力學(xué)分析表明，四個(gè)堿基的正常構(gòu)型均是異構(gòu)體中熱力學(xué)最穩(wěn)定的構(gòu)型，直接導(dǎo)致堿基正常構(gòu)型變化的異構(gòu)化過(guò)程均屬于熱力學(xué)上的非自發(fā)過(guò)程；在研究溫度范圍內(nèi)，根據(jù)平衡常數(shù)得到的最大異構(gòu)化率分別約為：胞嘧啶10<'-3>～10<'-2>；胸腺嘧啶10<'-13>～10<'-8>；腺嘌呤10<'-18>～10<'-12>：鳥(niǎo)嘌呤10<'-3>～10<'-2>。可見(jiàn)，四個(gè)堿基中胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤具有較大的平衡損傷比率。嘌呤堿基與嘧啶堿基

12、相比，無(wú)論是質(zhì)子轉(zhuǎn)移還是質(zhì)子擺動(dòng)，嘌呤堿基過(guò)渡態(tài)的虛頻率均小300左右，這說(shuō)明嘧啶堿基異構(gòu)化的隧道效應(yīng)大于嘌呤堿基的異構(gòu)化的隧道效應(yīng)。這個(gè)結(jié)果同時(shí)表明，在堿基的異構(gòu)化過(guò)程中，隧道效應(yīng)不僅與質(zhì)子遷移的方式有關(guān)，同時(shí)也受質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境的影響。 研究結(jié)果表明，原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移需要活化σ鍵和π鍵，而質(zhì)子擺動(dòng)過(guò)程基本上只需要活化π健，因此原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移的勢(shì)壘高于質(zhì)子擺動(dòng)的勢(shì)壘。異構(gòu)化過(guò)程的過(guò)渡態(tài)是由于分子振動(dòng)形成的。對(duì)于形成過(guò)渡態(tài)的振動(dòng)

13、模式，原子間質(zhì)子轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)原子的位移和多個(gè)鍵的伸縮和彎曲振動(dòng)，振動(dòng)能級(jí)躍遷需要較高的能量，而質(zhì)子擺動(dòng)主要涉及兩個(gè)原子的位移和一個(gè)鍵的伸縮振動(dòng)，這亦是造成反應(yīng)勢(shì)壘不同的原因。 4．堿基的水解脫氨損傷 DNA的四個(gè)堿基中有三個(gè)帶有環(huán)外氨基，可以通過(guò)水解脫除，其中胞嘧啶水解脫氨形成尿嘧啶，腺嘌呤水解脫氨形成次黃嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤水解脫氨形成黃嘌呤。研究結(jié)果表明，三個(gè)堿基水解脫氨過(guò)程均需要經(jīng)過(guò)兩個(gè)過(guò)渡態(tài)和一個(gè)中間體。反應(yīng)的第一階

14、段為堿基與水分子加成反應(yīng)形成中間體的過(guò)程，第二階段為中間體脫氨形成產(chǎn)物的過(guò)程。在堿基與水分子加成反應(yīng)的過(guò)程中，水分子中帶負(fù)電荷的O進(jìn)攻堿基骨架上與氨基相連的C=N雙鍵中帶正電荷的C，水分子中帶正電荷的H進(jìn)攻C=N雙鍵中帶負(fù)電荷的N，形成關(guān)鍵部分為四元環(huán)結(jié)構(gòu)的過(guò)渡態(tài)，此加成反應(yīng)屬于偶極加成反應(yīng)。在過(guò)渡態(tài)中O-H o單鍵和C=N雙鍵中的π鍵部分?jǐn)嗔?，H…N σ單鍵和O…C之間的π鍵部分形成。過(guò)渡態(tài)中新形成的四元環(huán)平面與堿基骨架平面的夾角小于

15、90<'。>。由于水分子與堿基之間O…C鍵的部分形成，使得氨基N原子也偏離了堿基的骨架平面。過(guò)渡態(tài)的形成過(guò)程同時(shí)伴隨著原子間的電荷轉(zhuǎn)移及其幾何結(jié)構(gòu)的變化。堿基與水分子形成中間體后，羥基H進(jìn)攻氨基N原子形成第二個(gè)過(guò)渡態(tài)。在第二個(gè)過(guò)渡態(tài)中，由于H的靠近，NH<,3>分子的框架基本形成，氨基N與堿基C的鍵合作用被大大削弱：同時(shí)，羥基O-H鍵部分?jǐn)嗔?，C…0之間π鍵部分形成。在過(guò)渡態(tài)的形成過(guò)程中，隨著氨基的逐漸遠(yuǎn)離，原羥基O也逐漸靠近堿基骨架平

16、面。胞嘧啶，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤與水分子加成反應(yīng)的反應(yīng)勢(shì)壘分別為258.2KJ/mol、200.6KJ/mol和202.7KJ/mol。顯然，嘌呤堿基與水分子的加成反應(yīng)比胞嘧啶與水分子的加成反應(yīng)容易發(fā)生。胞嘧啶，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤與水分子形成的中間體脫氨過(guò)程的反應(yīng)勢(shì)壘分別為159.0KJ/mol、136.7KJ/mol和153.0KJ/mol，說(shuō)明脫氨過(guò)程的勢(shì)壘要低于加成反應(yīng)的勢(shì)壘，中間體脫氨過(guò)程的速度要比加成反應(yīng)的速度快。也就是說(shuō)，堿基與水分子

17、的加成反應(yīng)是堿基水解脫氨損傷過(guò)程的控制步驟。過(guò)渡態(tài)的虛頻數(shù)值表明，中間體脫氨過(guò)程比堿基與水分子的加成反應(yīng)有更大的隧道效應(yīng)。 與單分子異構(gòu)化過(guò)渡態(tài)的形成機(jī)制不同，加成反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的形成需要分子兩種運(yùn)動(dòng)模式的共同作用：分子振動(dòng)使鍵得到活化，通過(guò)分子碰撞在合適的接觸模式形成加成反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)。 5．堿基的氧化脫氨損傷 亞硝酸氧化堿基脫氨的產(chǎn)物與堿基水解脫氨的產(chǎn)物相同，但亞硝酸氧化堿基脫氨的過(guò)程卻復(fù)雜得多，其原因來(lái)自兩個(gè)

18、方面：一是亞硝酸在溶液中的存在形式復(fù)雜，二是亞硝酸與堿基的反應(yīng)的產(chǎn)物復(fù)雜。在中性溶液或生理?xiàng)l件下，亞硝酸溶液中NO<,2>、HNO<,2>和N<,2>O<,3>三種形式共存，但以HNO<,2>和N<,2>O<,3>為主，它們均可能參與堿基的氧化脫氨過(guò)程。在亞硝酸氧化堿基脫氨的過(guò)程中，第一步為HNO<,2>或N<,2>O<,3>參與反應(yīng)生成堿基N-亞硝基衍生物(R-NH-NO)；第二步為N-亞硝基衍生物通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成堿基偶氮衍生物(R-

19、NN-OH)的過(guò)程；第三步為堿基偶氮衍生物脫除N<,2>形成烯醇式產(chǎn)物的過(guò)程；第四步為產(chǎn)物由烯醇式向酮式轉(zhuǎn)化的過(guò)程。其中第三步可以通過(guò)形成重氮鹽然后水解的反應(yīng)途徑，也可以由堿基的偶氮衍生物直接脫除N<,2>形成烯醇式產(chǎn)物。亞硝酸氧化胞嘧啶脫氨過(guò)程的研究結(jié)果表明，HNO<,2>與胞嘧啶作用脫除一分子H<,2>O，其結(jié)合屬于偶極加成反應(yīng)，形成的過(guò)渡態(tài)關(guān)鍵部分為四元壞結(jié)構(gòu)。N<,2>O<,3>與胞嘧啶作用脫除一分子HNO<,2>，反應(yīng)過(guò)程也屬

20、于偶極加成反應(yīng)，形成的過(guò)渡態(tài)關(guān)鍵部分為五元環(huán)結(jié)構(gòu)。過(guò)渡態(tài)的存在表明形成胞嘧啶N-亞硝基衍生物的過(guò)程為協(xié)同反應(yīng)過(guò)程，即舊鍵的斷裂和新鍵的形成同時(shí)發(fā)生。從過(guò)渡態(tài)的幾何和電荷分布來(lái)看，原子間的電荷轉(zhuǎn)移是肯定的。HNO<,2>與胞嘧啶反應(yīng)的勢(shì)壘大于N<,2>O<,3>與胞嘧啶反應(yīng)的勢(shì)壘，這說(shuō)明N<,2>O<,3>與堿基的作用比較容易發(fā)生，反應(yīng)速度較快，應(yīng)是形成胞嘧啶N-亞硝基衍生物的主要反應(yīng)通道，N<,2>O<,3>應(yīng)是亞硝酸參與胞嘧啶氧化脫氨

21、的主要形式。 胞嘧啶N-亞硝基衍生物通過(guò)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成胞嘧啶偶氮衍生物。其過(guò)渡態(tài)關(guān)鍵部分為四元環(huán)結(jié)構(gòu)，該四元環(huán)基本上與堿基骨架共平面。過(guò)渡態(tài)中N-H單鍵和C=O雙鍵中π鍵的斷裂、O-H單鍵和N=N雙鍵中π鍵的形成同時(shí)發(fā)生。胞嘧啶N-亞硝基衍生物分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成胞嘧啶偶氮衍生物的勢(shì)壘高于HNO<,2>和N<,2>O<,3>與胞嘧啶加成反應(yīng)的勢(shì)壘。胞嘧啶偶氮衍生物直接脫N<,2>形成烯醇式次黃嘌呤的過(guò)渡態(tài)的關(guān)鍵部分也為四元

22、環(huán)結(jié)構(gòu)，其中N2的結(jié)構(gòu)框架已基本形成，N<,2>部分與堿基間的鍵合作用變得很弱；兩個(gè)N原子上的電荷向其它原子發(fā)生了大幅度轉(zhuǎn)移，已經(jīng)變得很小。此過(guò)程的反應(yīng)勢(shì)壘為164.5KJ/mol。尿嘧啶通過(guò)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移由烯醇式向酮式轉(zhuǎn)化過(guò)程的過(guò)渡態(tài)與其它質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)大體類似，反應(yīng)勢(shì)壘為142.5KJ/mol。在亞硝酸氧化胞嘧啶脫氨的整個(gè)過(guò)程中，N<,2.O<,3>與胞嘧啶加成的反應(yīng)速度決定了胞嘧啶氧化脫氨損傷的速度；胞嘧啶偶氮衍生

23、物脫去N<,2>形成烯醇式次黃嘌呤的過(guò)程活化能最高，是形成次黃嘌呤的控制步驟。 研究結(jié)果表明，亞硝酸氧化腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤脫氨過(guò)程的機(jī)制、過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及其動(dòng)力學(xué)行為與亞硝酸氧化胞嘧啶脫氨過(guò)程類似。 6．水分子參與的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程 堿基的異構(gòu)化、水解脫氨和氧化脫氨過(guò)程均涉及分子內(nèi)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移。由于這些反應(yīng)的環(huán)境中均存在水，因此水分子可能參與分子內(nèi)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程。我們研究了水分子參與胞嘧啶正常構(gòu)型和胞嘧啶N-亞硝基衍生物分

24、子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程。結(jié)果表明，水分子可首先與胞嘧啶或胞嘧啶N-亞硝基衍生物形成氫鍵復(fù)合物，然后通過(guò)形成包含六元環(huán)結(jié)構(gòu)的過(guò)渡態(tài)發(fā)生質(zhì)子傳遞。在過(guò)渡態(tài)中，參與傳遞的兩個(gè)H原子與中心O的距離基本相等。由于這種傳遞過(guò)程不需要分子幾何的大幅度變化，需要的能量要小得多，因此反應(yīng)勢(shì)壘大幅度降低。研究結(jié)果表明，在研究水分子參與堿基質(zhì)子轉(zhuǎn)移的過(guò)程時(shí)，必須考慮氫鍵復(fù)合物的形成，否則，有可能低估反應(yīng)的勢(shì)壘。水分子的參與可以大大加快分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程的速度是因?yàn)?/p>

25、水分子參與了過(guò)渡態(tài)的形成，改變了質(zhì)子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)途徑，使得胞嘧啶N-亞硝基衍生物的質(zhì)子轉(zhuǎn)移由分子內(nèi)的直接轉(zhuǎn)移過(guò)程變?yōu)橥ㄟ^(guò)水分子的質(zhì)子交換傳遞過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，水分子的作用相當(dāng)于催化劑。根據(jù)物理化學(xué)原理，水分子的參與只能影響過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，而不可能改變過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)，因此質(zhì)子轉(zhuǎn)移的化學(xué)平衡不受影響。 總之，通過(guò)對(duì)堿基異構(gòu)化、水解脫氨和氧化脫氨等DNA損傷過(guò)程的理論研究，初步闡明了上述過(guò)程的分子機(jī)制和熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)行為。這些結(jié)果