西瓜果實(shí)成熟乙烯調(diào)控的生理及分子機(jī)制初探.pdf

1、植物肉質(zhì)果實(shí)成熟是高度復(fù)雜但協(xié)調(diào)有序的遺傳調(diào)控過程。乙烯已被明確為控制呼吸躍變型果實(shí)成熟的關(guān)鍵激素。近年來，在部分非呼吸躍變型果實(shí)如草莓、葡萄、柑橘等中同樣也發(fā)現(xiàn)乙烯參與了其成熟調(diào)控過程，并已取得重要研究進(jìn)展。西瓜傳統(tǒng)上被劃分為非呼吸躍變型果實(shí)。與野生西瓜不同，栽培西瓜成熟時(shí)果肉顏色、質(zhì)地、風(fēng)味等均發(fā)生顯著變化，但其成熟機(jī)理尚知之甚少。本論文以果實(shí)成熟調(diào)控研究模式作物番茄為參照，通過早熟栽培西瓜品種97103和不能成熟的野生西瓜種質(zhì)PI

2、296341-FR進(jìn)行生理生化及轉(zhuǎn)錄組的對(duì)比分析，系統(tǒng)研究了乙烯在參與西瓜果實(shí)成熟中的作用及其生理與分子調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)對(duì)差異顯著表達(dá)的ERF基因ClERF069進(jìn)行了功能驗(yàn)證，取得如下主要結(jié)果:
　　1、西瓜果肉組織中乙烯合成水平很低，但可能在成熟調(diào)控中發(fā)揮重要作用。西瓜果實(shí)釋放乙烯量極低以至難以測(cè)定，而果實(shí)組織內(nèi)乙烯含量相對(duì)要高，且真實(shí)反映了其乙烯合成水平。栽培西瓜97103成熟期內(nèi)果肉組織內(nèi)乙烯水平大概只有呼吸躍變型果實(shí)番茄的

3、1/10，但成熟起始時(shí)（授粉后18天），果肉組織內(nèi)乙烯含量明顯上升（增加了約3倍）并達(dá)到峰值。而野生西瓜PI296341-FR果肉組織內(nèi)乙烯含量整個(gè)發(fā)育期基本穩(wěn)定維持在較低的水平。用外源乙烯處理兩個(gè)西瓜品種，栽培西瓜97103授粉后10天和授粉后18天的果肉組織明顯變軟，顏色發(fā)育明顯加快，主要色素物質(zhì)番茄紅素、β-胡蘿卜素等相比對(duì)照明顯增加。而野生西瓜PI296341-FR果肉組織也明顯變軟，但瓤色未發(fā)生變化。以上結(jié)果說明，乙烯可能在西

4、瓜果實(shí)軟化以及類胡蘿卜素合成的瓤色發(fā)育等成熟性狀代謝調(diào)控中充當(dāng)重要角色。
　　2、西瓜發(fā)育成熟過程中，兩個(gè)ACS基因和兩個(gè)ACO基因在果肉組織乙烯合成代謝中起關(guān)鍵作用，可能也是構(gòu)成類似呼吸躍變型果實(shí)的乙烯合成系統(tǒng)Ⅱ的重要成員。栽培西瓜97103和野生西瓜PI296341-FR發(fā)育成熟過程中，果肉組織內(nèi)ACS和ACO酶活性變化與乙烯含量之間表現(xiàn)出同步性。西瓜全基因組上共鑒定出八個(gè)ACS基因和八個(gè)ACO基因。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)

5、整個(gè)發(fā)育成熟過程中，ACS基因Cla022653、Cla011522和ACO基因Cla014827、Cla016287在兩個(gè)品種果肉組織內(nèi)的表達(dá)量均與ACS、ACO酶活性以及乙烯含量之間存在同步性。用外源乙烯處理，97103西瓜果肉組織內(nèi)源乙烯含量顯著增加，說明西瓜果肉中乙烯合成具有類似呼吸躍變型果實(shí)自我催化的乙烯合成系統(tǒng)Ⅱ特性。這種類似的乙烯合成系統(tǒng)Ⅱ不僅存在于西瓜成熟果肉組織內(nèi)（授粉后18天），在未成熟果肉組織中（授粉后10天）也同

6、樣存在。ACS基因Cla011522、Cla022653以及ACO基因Cla014827、Cla016287表達(dá)量均受外源乙烯誘導(dǎo)而上升，說明這四個(gè)基因在西瓜果實(shí)成熟過程中對(duì)乙烯合成起重要作用，可能也是構(gòu)成乙烯合成系統(tǒng)Ⅱ的重要成員。
　　3、基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)和共表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)NAC、HD-Zip、ERF等多個(gè)基因家族轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控了西瓜果實(shí)乙烯合成。結(jié)合基因組注釋和西瓜97103、PI296341-FR不同發(fā)育成熟時(shí)期

7、的果皮、果肉組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，我們對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及乙烯上游調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析和共表達(dá)分析，得到幾個(gè)在西瓜成熟過程中可能參與乙烯合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因，如MADS-box家族基因Cla017291、NAC家族基因Cla019099、HD-Zip家族基因Cla017080等。同時(shí)分析還發(fā)現(xiàn)，多個(gè)ERF基因在表達(dá)上與成熟呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，而且與乙烯合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NAC和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子以及類胡蘿卜素

8、合成及果實(shí)軟化等成熟代謝關(guān)鍵酶基因間都存在共表達(dá)關(guān)系，形成了以其為核心的共表達(dá)基因簇。因此，在乙烯信號(hào)介導(dǎo)的成熟調(diào)控及乙烯合成調(diào)控中ERF家族基因可能起到非常重要的作用。
　　4、西瓜ERF基因ClERF069轉(zhuǎn)化番茄并過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，番茄果實(shí)乙烯合成受到抑制且果實(shí)成熟延遲?；谠耘辔鞴?7103和PI296341-FR雜交形成的重組自交系群體進(jìn)行了成熟相關(guān)性狀的QTL精細(xì)定位結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)控制類胡蘿卜素和可溶性糖合成的主定位區(qū)間內(nèi)4

9、00多個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜差異表達(dá)篩選，得到一個(gè)重要的ERF家族候選基因Cla013424，并命名為ClERF069。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，RILs群體中果肉組織番茄紅素和可溶性糖含量與ClERF069基因表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)。在此研究基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將CaMV35S∶ClERF069轉(zhuǎn)入M82番茄中過表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因番茄T2代多個(gè)株系，發(fā)現(xiàn)ClERF069基因過表達(dá)的番茄果實(shí)番茄紅素和β-胡蘿卜素含量降低，果實(shí)成熟時(shí)間延