生物細(xì)胞內(nèi)含磷代謝物及游離鎂離子的核磁共振研究.pdf

1、核磁共振(NMR)方法作為一種無損傷檢測方法正越來越廣泛地應(yīng)用于活細(xì)胞、組織器官，乃至整體動物和人體中復(fù)雜小分子化合物的體內(nèi)變化研究，這種全新的無損傷方法也用來測定生物細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子的濃度、細(xì)胞內(nèi)pH值并取得了一定的進(jìn)展。核磁共振測定生物細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子的方法近年來多應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、生物分析等方面。NMR方法可以無損傷地對細(xì)胞內(nèi)游離Mg2+濃度進(jìn)行測定，同時可以考察細(xì)胞的代謝情況，允許在較長時間內(nèi)連續(xù)進(jìn)行觀察。核磁共振方法研究Mg2+

2、一般有兩種方法：31pNMR和19FNMR。目前31pNMR應(yīng)用比較廣泛，在研究Mg2+的同時可以對含磷代謝物等其它生理指標(biāo)進(jìn)行考察，還可以測定細(xì)胞內(nèi)的pH，而且所研究的對象范圍很廣，包括離體器官、灌流心臟、懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞及血小板等。本文采用31pNMR對cos-7細(xì)胞、兔血小板和人血小板等樣品進(jìn)行了分析測定，并合成了19FNMR測定鎂離子的指示劑5F-APTRA。本論文共包括4章。 第1章綜述了利用核磁共振方法來考察生物細(xì)

3、胞內(nèi)含磷小分子代謝物以及游離鎂離子濃度的研究現(xiàn)狀。 第2章采用31PNMR方法考察了貼壁細(xì)胞、血小板的含磷代謝物以及細(xì)胞內(nèi)pH。將培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞cos-7在對數(shù)生長期進(jìn)行收集，離心稀釋成濃度大于108細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，裝進(jìn)核磁共振管進(jìn)行31pNMR的測定。然后對所得譜圖進(jìn)行分析，根據(jù)無機(jī)磷(Pi)的化學(xué)位移的變化測定細(xì)胞內(nèi)的pH。兔血小板由抽取新鮮的兔血經(jīng)離心得到，人血小板由醫(yī)院提供。將兩者分別進(jìn)行31pNMR的測定，考察了

4、其中含磷代謝物及其pH值。測得cos-7細(xì)胞和兔血小板的無機(jī)磷化學(xué)位移分別為4.69±0.06(n=3)和4.64±0.05(n=3)，pH分別為5.58±0.04和5.39±0.02。 第3章建立了31pNMR測定鎂離子的方法，ATP與細(xì)胞內(nèi)游離的鎂離子結(jié)合，通過利用測量ATP中磷的α和β峰的化學(xué)位移差值，能精確確定MgATP和整個ATP的比值，而不需要在細(xì)胞樣品與對照組中加入內(nèi)標(biāo)來確定化學(xué)位移。根據(jù)模擬細(xì)胞內(nèi)離子強(qiáng)度和酸度等

5、條件下MgATP的解離常數(shù)KDMgATP，能計(jì)算出游離鎂離子的濃度。 第4章建立了19FNMR測定鎂離子的方法并進(jìn)行了5F-APTRA指示劑的合成：原料2，4-二氟硝基苯經(jīng)過與氫氧化鉀反應(yīng)生成5-氟-2-硝基酚，然后催化氫化生成5-氟-2-氨基酚，再與溴乙酸甲酯在質(zhì)子吸收劑作用下酯化，得到5F-APTRA指示劑。對合成5F-APTRA指示劑的原料及所需試劑進(jìn)行了合成：5-氟-2-硝基酚，質(zhì)子吸收劑1，8-二(二甲氨基)萘，乙酸溴