去鹵化酶催化作用機(jī)制的理論研究.pdf

1、去鹵化酶可以催化碳鹵鍵的水解斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的醇和鹵離子。去鹵化酶對(duì)含鹵環(huán)境污染物具有重要的生物降解作用，長(zhǎng)期以來一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　目前研究的去鹵化酶主要有五種:烷基鹵去鹵化酶、鹵代酸去鹵化酶、4-氯苯甲酰-輔酶 A去鹵化酶、鹵代醇去鹵化酶和3-鹵丙烯酸去鹵化酶。它們以不同的催化機(jī)制作用于多種有機(jī)鹵化物，使碳鹵鍵斷裂。前三種酶催化時(shí)都是取代機(jī)制，經(jīng)歷一個(gè)酯酶中間體。后兩者雖與前三種是類似的酶，但在不同的化學(xué)環(huán)境中催化機(jī)制不

2、同。這些去鹵化酶的結(jié)構(gòu)相似，卻具有底物特異性。另外，由于去鹵化酶的種類很多，它的多樣性使得底物范圍大大拓寬，包括鹵代烷烴、鹵代環(huán)烷烴、鹵代醇、鹵代氨基化合物和鹵代烯烴等。
　　其中，烷基鹵去鹵化酶是去鹵化酶中一種典型且應(yīng)用非常廣泛的生物降解酶。1993年烷基鹵去鹵化酶(DhlA)晶體結(jié)構(gòu)的確定，使得它的催化作用機(jī)制引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注。目前對(duì)這種去鹵化酶的研究取得了一定進(jìn)展，但在研究烷基鹵去鹵化酶催化去鹵的兩步反應(yīng)機(jī)制時(shí)，S

3、N2親核取代反應(yīng)和酯酶中間體的水解反應(yīng)的機(jī)理一直是人們爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。為了進(jìn)一步說明去鹵化酶催化動(dòng)力的來源，本文使用量子化學(xué)中的密度泛函理論對(duì)SN2親核取代反應(yīng)和酯酶中間體的水解反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了研究，為實(shí)驗(yàn)上研究去鹵化酶的進(jìn)化，提高去鹵化酶的生物催化活性和拓寬底物范圍提供了理論基礎(chǔ)。
　　本論文的主要內(nèi)容為:
　　1、我們用密度泛函理論對(duì)DhlA酶的SN2親核取代反應(yīng)進(jìn)行了研究。研究表明，在DhlA酶的催化反應(yīng)中，Asp124的

4、碳酸基團(tuán)以SN2親核取代的方式進(jìn)攻連接在底物上離去氯離子的碳上，得到酯酶中間體和氯離子。氧離子空穴和鹵穩(wěn)定殘基上的不同的氫鍵相互作用在酶催化反應(yīng)中意義重大。氧離子空穴上氫鍵的存在使得Asp124的羧酸基團(tuán)更加靠近底物DCE，使得反應(yīng)部位活性很高。在反應(yīng)復(fù)合物中，Trp125起主要的穩(wěn)定作用，而Trp125和Trp175在過渡態(tài)中都起非常重要的穩(wěn)定作用。研究酶催化反應(yīng)的溶劑效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，酶的催化作用主要在于酶中的反應(yīng)物相對(duì)于非酶催化反應(yīng)的反應(yīng)

5、物的不穩(wěn)定作用?？傊?，酶催化主要是反應(yīng)物相對(duì)不穩(wěn)定和過渡態(tài)相對(duì)穩(wěn)定的共同作用，使得能壘降低6.12 kcal/mol。
　　DhlA和LinB為同源酶?；罨瘎?shì)壘分析表明，在它們的催化反應(yīng)過程中都發(fā)生了SN2親核取代反應(yīng)。然而，這些酶的催化殘基和活性中心是不同的?；钚灾行牡腄CE的構(gòu)象自由。底物的兩種鄰位交叉式構(gòu)象對(duì)反應(yīng)的進(jìn)行非常重要。DhlA酶催化時(shí)，底物的鄰位交叉式構(gòu)象(D(Cl1–C1–C2–Cl2)=-60°)容易發(fā)生去鹵反

6、應(yīng)；而LinB酶催化反應(yīng)時(shí)，另一鄰位交叉式構(gòu)象(D(Cl1–C1–C2–Cl2)=+60°)易于發(fā)生去鹵化反應(yīng)。
　　2、我們使用密度泛函方法研究了DhlA酶催化的酯酶中間體的水解反應(yīng)。結(jié)果表明，酯酶中間體的水解反應(yīng)涉及到His289活化的水分子與酯基的的親核加成反應(yīng)，同時(shí)伴隨著水親核試劑的質(zhì)子遷移反應(yīng)。酯酶中間體的水解經(jīng)歷了一個(gè)四面體中間體結(jié)構(gòu)。然后消除和質(zhì)子遷移反應(yīng)導(dǎo)致四面體中間體的分解，最后得到相應(yīng)的醇、鹵離子和Asp124

7、。在這兩個(gè)反應(yīng)途徑中，第一步AdN反應(yīng)都是決速步驟。氣相中，質(zhì)子化His289的質(zhì)子遷移途徑的勢(shì)壘比脫質(zhì)子水的質(zhì)子遷移途徑的低0.13 kcal/mol。因此，質(zhì)子化His289的質(zhì)子遷移途徑是優(yōu)勢(shì)通道。苯中它的勢(shì)壘比脫質(zhì)子水的質(zhì)子遷移途徑的低0.67 kcal/mol。
　　研究酯酶中間體水解反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，水促進(jìn)的水解反應(yīng)與質(zhì)子化 His289的質(zhì)子遷移途徑的三步反應(yīng)機(jī)制是有差異的。水促進(jìn)的水解反應(yīng)涉及兩步反應(yīng):第一步為AdN反應(yīng)