去鹵化酶催化作用機制的理論研究.pdf

1、去鹵化酶可以催化碳鹵鍵的水解斷裂，產生相應的醇和鹵離子。去鹵化酶對含鹵環(huán)境污染物具有重要的生物降解作用，長期以來一直是人們關注的熱點。
　　目前研究的去鹵化酶主要有五種:烷基鹵去鹵化酶、鹵代酸去鹵化酶、4-氯苯甲酰-輔酶 A去鹵化酶、鹵代醇去鹵化酶和3-鹵丙烯酸去鹵化酶。它們以不同的催化機制作用于多種有機鹵化物，使碳鹵鍵斷裂。前三種酶催化時都是取代機制，經歷一個酯酶中間體。后兩者雖與前三種是類似的酶，但在不同的化學環(huán)境中催化機制不

2、同。這些去鹵化酶的結構相似，卻具有底物特異性。另外，由于去鹵化酶的種類很多，它的多樣性使得底物范圍大大拓寬，包括鹵代烷烴、鹵代環(huán)烷烴、鹵代醇、鹵代氨基化合物和鹵代烯烴等。
　　其中，烷基鹵去鹵化酶是去鹵化酶中一種典型且應用非常廣泛的生物降解酶。1993年烷基鹵去鹵化酶(DhlA)晶體結構的確定，使得它的催化作用機制引起國內外科學家的廣泛關注。目前對這種去鹵化酶的研究取得了一定進展，但在研究烷基鹵去鹵化酶催化去鹵的兩步反應機制時，S

3、N2親核取代反應和酯酶中間體的水解反應的機理一直是人們爭論的焦點。為了進一步說明去鹵化酶催化動力的來源，本文使用量子化學中的密度泛函理論對SN2親核取代反應和酯酶中間體的水解反應的機理進行了研究，為實驗上研究去鹵化酶的進化，提高去鹵化酶的生物催化活性和拓寬底物范圍提供了理論基礎。
　　本論文的主要內容為:
　　1、我們用密度泛函理論對DhlA酶的SN2親核取代反應進行了研究。研究表明，在DhlA酶的催化反應中，Asp124的

4、碳酸基團以SN2親核取代的方式進攻連接在底物上離去氯離子的碳上，得到酯酶中間體和氯離子。氧離子空穴和鹵穩(wěn)定殘基上的不同的氫鍵相互作用在酶催化反應中意義重大。氧離子空穴上氫鍵的存在使得Asp124的羧酸基團更加靠近底物DCE，使得反應部位活性很高。在反應復合物中，Trp125起主要的穩(wěn)定作用，而Trp125和Trp175在過渡態(tài)中都起非常重要的穩(wěn)定作用。研究酶催化反應的溶劑效應發(fā)現，酶的催化作用主要在于酶中的反應物相對于非酶催化反應的反應

5、物的不穩(wěn)定作用。總之，酶催化主要是反應物相對不穩(wěn)定和過渡態(tài)相對穩(wěn)定的共同作用，使得能壘降低6.12 kcal/mol。
　　DhlA和LinB為同源酶?；罨瘎輭痉治霰砻?，在它們的催化反應過程中都發(fā)生了SN2親核取代反應。然而，這些酶的催化殘基和活性中心是不同的?；钚灾行牡腄CE的構象自由。底物的兩種鄰位交叉式構象對反應的進行非常重要。DhlA酶催化時，底物的鄰位交叉式構象(D(Cl1–C1–C2–Cl2)=-60°)容易發(fā)生去鹵反

6、應；而LinB酶催化反應時，另一鄰位交叉式構象(D(Cl1–C1–C2–Cl2)=+60°)易于發(fā)生去鹵化反應。
　　2、我們使用密度泛函方法研究了DhlA酶催化的酯酶中間體的水解反應。結果表明，酯酶中間體的水解反應涉及到His289活化的水分子與酯基的的親核加成反應，同時伴隨著水親核試劑的質子遷移反應。酯酶中間體的水解經歷了一個四面體中間體結構。然后消除和質子遷移反應導致四面體中間體的分解，最后得到相應的醇、鹵離子和Asp124

7、。在這兩個反應途徑中，第一步AdN反應都是決速步驟。氣相中，質子化His289的質子遷移途徑的勢壘比脫質子水的質子遷移途徑的低0.13 kcal/mol。因此，質子化His289的質子遷移途徑是優(yōu)勢通道。苯中它的勢壘比脫質子水的質子遷移途徑的低0.67 kcal/mol。
　　研究酯酶中間體水解反應時發(fā)現，水促進的水解反應與質子化 His289的質子遷移途徑的三步反應機制是有差異的。水促進的水解反應涉及兩步反應:第一步為AdN反應