古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的質(zhì)子泵機(jī)理及其與聚合物復(fù)合功能材料的研究.pdf

1、本文對(duì)古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的質(zhì)子泵機(jī)理及其與聚合物復(fù)合功能材料進(jìn)行了研究。文章的主要?jiǎng)?chuàng)造性工作和成果為： (一)研究了AR4蛋白的光循環(huán)性質(zhì)和質(zhì)子泵機(jī)理，提出弱偶聯(lián)模型解釋AR4的特殊現(xiàn)象。在與BR相比較的基礎(chǔ)上，考察了AR4質(zhì)子泵功能和光循環(huán)性質(zhì)的pH依賴性，測(cè)定了其幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸在光循環(huán)中各個(gè)狀態(tài)的pKa值，發(fā)現(xiàn)在高pH區(qū)域，AR4蛋白光循環(huán)中的質(zhì)子提取與釋放順序發(fā)生反向，從而與BR蛋白在中性pH環(huán)境中的順序一致。指出AR4光

2、循環(huán)中，Asp85質(zhì)子化與蛋白質(zhì)子釋放之間的弱偶聯(lián)效應(yīng)是導(dǎo)致AR4與BR蛋白光循環(huán)中相反的質(zhì)子提取和釋放順序的原因。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)AR4中質(zhì)子釋放基團(tuán)并沒有失去功能，而是在催化質(zhì)子受體Asp85的去質(zhì)子化、加速AR4光循環(huán)最后過(guò)程中質(zhì)子在質(zhì)子釋放通道內(nèi)部的傳遞和AR4初態(tài)的回復(fù)上發(fā)揮了重要的作用。與BR相比，AR4是一個(gè)堿化了的質(zhì)子泵。 (二)研究了去垢劑TritonX-100對(duì)AR4蛋白質(zhì)子泵功能的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的自組裝聚集狀

3、態(tài)對(duì)于AR4的質(zhì)子泵功能有重要影響。發(fā)現(xiàn)TritonX-100可以改變AR4蛋白光循環(huán)中的質(zhì)子提取與釋放的順序，AR4聚集體與AR4單體具有截然相反的質(zhì)子提取與釋放順序。并且，用Biobeads去除體系的TrionX-100后，AR4蛋白的這種質(zhì)子提取與釋放順序還可以得到恢復(fù)。表明脂與蛋白的相互作用及蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)在影響AR4中的Asp85質(zhì)子化與質(zhì)子釋放之間的偶聯(lián)作用，以及調(diào)節(jié)其光循環(huán)中質(zhì)子泵次序方面起到了重要的作用。 (三

4、)研究了轉(zhuǎn)基因AR4蛋白與野生AR4及BR蛋白質(zhì)子泵功能的差異。通過(guò)合作研究，將AR4和BR基因在一株本身不合成菌紫質(zhì)和玉紅素的嗜鹽菌株L33中克隆和表達(dá)，本論文發(fā)現(xiàn)：在L33中表達(dá)的AR4蛋白(稱為轉(zhuǎn)基因AR4蛋白)表現(xiàn)出與野生AR4蛋白以及BR蛋白都不相同的光循環(huán)和質(zhì)子泵性質(zhì)，其Asp85質(zhì)子化與質(zhì)子釋放之間的偶聯(lián)作用以及其他很多性質(zhì)都介于野生AR4和BR之間。轉(zhuǎn)基因AR4與BR蛋白具有相同的脂環(huán)境，其性質(zhì)的差異由其不同的氨基酸序列

5、所導(dǎo)致；而轉(zhuǎn)基因AR4與野生AR4蛋白具有相同的氨基酸序列，其性質(zhì)的差異歸咎于其所不同的脂環(huán)境(轉(zhuǎn)基因AR4的紫膜環(huán)境和野生AR4的紫紅膜環(huán)境)。因此，我們提出AR4蛋白中一些特殊的氨基酸殘基和其特殊的脂環(huán)境共同決定了其在光循環(huán)中與BR相反的質(zhì)子提取與釋放順序。 (四)研究了兩種新型BR蛋白和AR4蛋白突變體，BR-D96V和AR4-D212G的質(zhì)子泵功能和光循環(huán)性質(zhì)，同時(shí)將野生BR、D96NBR和野生AR4蛋白作為它們性質(zhì)研究

6、的對(duì)照。將酸性氨基酸Asp96(D96)突變成了一個(gè)非常疏水的氨基酸Val(V)，并沒有影響到BR蛋白基本的折疊結(jié)構(gòu)，D96VBR同樣具有質(zhì)子泵功能，并且其光適應(yīng)向暗適應(yīng)的轉(zhuǎn)變行為與野生BR相似。中性pH值條件下，D96V突變的BR蛋白光循環(huán)中M產(chǎn)物的壽命和野生BR相比有了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上的延長(zhǎng)，與D96NBR的M產(chǎn)物壽命接近。提高體系的pH值可以使D96VBR光循環(huán)中M產(chǎn)物壽命有著更加顯著的延長(zhǎng)。結(jié)果表明，該位點(diǎn)的基因突變修飾優(yōu)化了BR

7、蛋白作為光信息存儲(chǔ)和處理材料的性能。AR4蛋白的D212G突變則改變了其光循環(huán)中的質(zhì)子提取與釋放順序，從而使其與BR中的順序一致，表明Asp212(D212)對(duì)AR4蛋白質(zhì)子泵的次序有著至關(guān)重要的作用。 (五)初步考察了重組的上述蛋白質(zhì)與聚合物復(fù)合體系以及潛在的光信息材料。通過(guò)基因工程改性成功地使AR4蛋白具備了一定的潛在應(yīng)用價(jià)值，并在聚合物和BR蛋白的改性以增強(qiáng)它們之間的相互作用、制備光學(xué)尺度均勻的復(fù)合材料上作出了探索。與BR

8、相比，AR4中的玉紅素掩蓋了其吸收峰，削弱了其光致色變的反差，從而阻礙了其在光信息存儲(chǔ)方面的可能應(yīng)用。通過(guò)基因工程的方法成功去除了玉紅素，并采用定點(diǎn)突變的方法優(yōu)化其功能，將其包埋于聚合物中制成復(fù)合膜，采用簡(jiǎn)易的方法實(shí)現(xiàn)了其可視化的圖像存儲(chǔ)，使AR4蛋白也同樣可以應(yīng)用于信息存儲(chǔ)和信息處理領(lǐng)域。在復(fù)合材料的制備研究中，使用兩親性的溫度敏感水凝膠材料復(fù)合成膜或者凝膠，增強(qiáng)了蛋白與聚合物的相互作用，對(duì)制備分子尺度上均勻的BR光學(xué)材料進(jìn)行了嘗試。