多功能性玉米醇溶蛋白基遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及生物學(xué)評價.pdf

1、天然高分子憑借其生物相容性好、可降解、易修飾等多種性質(zhì)，已成為制備納米材料的主要基材。通過自組裝制備的天然高分子納米載體更是由于其安全無毒、制備簡單、表面易修飾、載藥量高、控釋性能好等優(yōu)勢，在藥物及營養(yǎng)素遞送方面受到越來越多的關(guān)注。目前，提高納米粒子的穩(wěn)定性和功能性，并實現(xiàn)高效靶向遞送，已成為遞送領(lǐng)域研究的研究熱點。
　　本文以玉米醇溶蛋白(zein)為主要基材，通過自組裝的方式與兩種不同形式的多糖（陰離子多糖—羧甲基纖維素鈉和陽

2、離子多糖—季銨鹽殼聚糖）自組裝形成納米粒子。以疏水性藥物紫杉醇(PTX)和疏水性營養(yǎng)素姜黃素(Cur)為模型負(fù)載物，研究納米運(yùn)載體系對疏水性物質(zhì)的包封、保護(hù)以及體外緩釋的性質(zhì)，通過細(xì)胞實驗驗證載藥納米粒子的生物學(xué)特性。為進(jìn)一步提高抗癌藥物的療效、降低毒副性，賦予運(yùn)載體系定向性釋放的性質(zhì)，在已制備的納米粒子表面形成一層單寧酸-金屬離子包被膜，通過膜的pH-響應(yīng)性崩解，賦予納米粒子pH-響應(yīng)性釋藥的性質(zhì)。
　　本文主要研究結(jié)果如下:<

3、br>　　1.選擇PTX作為疏水模型藥物，通過自組裝方法制備負(fù)載PTX的玉米醇溶蛋白/羧甲基纖維素鈉納米粒子(PTX-zein/CMC納米粒子)。結(jié)果顯示當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與多糖質(zhì)量比為1∶3，投藥量為80μg/mL時，所得納米粒子粒徑為159.4 nm，載藥率高達(dá)93.5％。在此條件下可得到分散均勻的球形納米粒子，且其具有良好的pH穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性。體外緩釋實驗表明，相比于游離藥物的快速釋放，載藥納米粒子呈現(xiàn)明顯的緩釋特性。細(xì)胞吞噬實驗表明，

4、藥物敏感的HepG2細(xì)胞和藥物抗性的MCF-7細(xì)胞對香豆素6標(biāo)記的納米粒子的細(xì)胞吞噬均呈時間依賴性。同時，對于藥物抗性的MCF-7細(xì)胞，在高給藥濃度下，載藥納米粒子比游離藥物顯示更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。細(xì)胞凋亡實驗顯示，對于抗性細(xì)胞，載藥納米粒子組引起的細(xì)胞凋亡比例大于游離藥物的。免疫熒光實驗表明載藥納米粒子和游離的PTX均是通過促進(jìn)微管的增生導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　2.研究陽離子多糖（季銨鹽殼聚糖，HTCC）與zein的組裝行為，利用自組裝

5、制備納米粒子，用于疏水性營養(yǎng)素Cur的負(fù)載。通過對殼聚糖季銨化改性，大大提高了殼聚糖在中性條件以及堿性條件下的溶解性。改變蛋白質(zhì)/多糖質(zhì)量比可以得到不同粒徑、不同多分散系數(shù)(PDI)、不同負(fù)載率的納米粒子。當(dāng)固定多糖為HTCC1(Mw8.708×103)，蛋白質(zhì)/多糖質(zhì)量比為1∶1時，所得納米粒子的負(fù)載率最高。與單純的zein納米粒子相比，形成的zein/HTCC納米粒子分布更加均勻，形狀更加規(guī)整。將Cur負(fù)載于納米粒子可顯著提高其光、

6、熱穩(wěn)定性，且在相同的處理條件下相比于游離Cur具有更強(qiáng)的抗氧化活性。
　　3.為了進(jìn)一步提高構(gòu)建的遞送體系的高效性，在之前的研究基礎(chǔ)上，引入了具有pH響應(yīng)性的響應(yīng)因子?；趩螌幩?TA)分子與蛋白質(zhì)之間具有較強(qiáng)相互作用的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)及其優(yōu)異的金屬螯合能力，以金屬離子為交聯(lián)劑在zein納米粒子表面形成一層金屬-有機(jī)涂層，成功構(gòu)建了一種新型的具有pH響應(yīng)性的納米載體（zein-TA/metal納米粒子）。通過透射電子顯微鏡(TEM)對

7、其微觀形貌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)這種雜化納米粒子具有更佳的分散性且粒徑更加均一，克服了大部分納米粒子在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定的問題。傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析表明，TA與金屬離子之間存在較強(qiáng)的配位作用，同時TA與蛋白質(zhì)之間也存在著氫鍵相互作用與靜電相互作用。使用X射線光電子能譜(XPS)對納米粒子表面元素進(jìn)行分析，金屬離子特征峰的出現(xiàn)以及C/O比值的顯著變化均有效證明TA與金屬離子的引入。隨后以阿霉素(DOX)為模型藥物，對其包封率、緩釋性能進(jìn)行

8、研究。結(jié)果顯示，相比于zein納米粒子，包被納米粒子對藥物的包封率顯著提高且在中性條件下(pH=7.4)具有良好的緩釋性能，阻止了突釋現(xiàn)象的發(fā)生。同時，由于TA-CuⅡ復(fù)合膜具有pH響應(yīng)性，賦予包被納米粒子良好的pH響應(yīng)性釋藥的性質(zhì)。
　　細(xì)胞吞噬實驗表明，與游離的DOX相比，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的納米粒子速度較緩慢;對于包被的納米粒子，由于對藥物的pH響應(yīng)性釋放，孵育較長時間才能觀察到細(xì)胞內(nèi)DOX的紅色熒光。位于包被納米粒子表面

9、的TA可以原位還原金納米粒子，該體系為癌癥的光熱療法提供了新思路。
　　4.為了能更加精細(xì)的調(diào)控納米載體的pH響應(yīng)性，利用TA對基體的粘附性以及金屬螯合能力、氨基與金屬之間的配位作用，在zein納米粒子中引入含有氨基的HTCC，在制備的zein/HTCC納米粒子表面包被一層金屬-有機(jī)涂層。同時利用TA-金屬離子以及氨基-金屬離子之間配位鍵的pH響應(yīng)性，賦予納米粒子pH響應(yīng)釋藥的特性。與zein/HTCC納米粒子相比，形成的包被納米

10、粒子（zein-HTCC/TA-metal納米粒子）分散性更好，粒徑分布更加均勻，形狀更加規(guī)整。FT-IR研究表明，TA與金屬離子之間存在較強(qiáng)的配位作用;同時TA，HTCC與蛋白質(zhì)之間也存在著靜電相互作用。XPS研究進(jìn)一步驗證了包被納米粒子表面金屬離子和TA的存在。以DOX為藥物模型研究發(fā)現(xiàn)，包被的納米粒子對藥物的包封率相比于zein/HTCC納米粒子也有顯著的提高。體外緩釋實驗表明以不同金屬離子作為交聯(lián)中心及金屬離子添加量的變化均會導(dǎo)

11、致載藥納米粒子釋放行為的變化。與zein-TA/metal納米粒子相比，zein-HTCC/TA-metal納米粒子呈現(xiàn)出更優(yōu)異的刺激響應(yīng)性。
　　細(xì)胞吞噬實驗顯示未經(jīng)包被的納米粒子存在明顯的突釋現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中即可快速釋放DOX。對于包被納米粒子，由于對藥物的pH響應(yīng)性釋放，孵育較長時間才能觀察到較強(qiáng)的熒光。同時引入稀土元素，使其同時具有pH響應(yīng)性和生物成像的功能。
　　5.考察金屬離子種類及化學(xué)計量比對TA-金屬離子包被

12、納米粒子（zein-TA/meta）性質(zhì)的影響。金屬離子種類可顯著影響殼層厚度致使納米粒子的粒徑不同;金屬離子濃度的增加會引起包被納米粒子粒徑的增加。在較低金屬離子濃度下，包被的納米粒子在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性大大提到。但是對于TA-CuⅡ包被的納米粒子，隨著金屬離子濃度的增大，形成的納米粒子在培養(yǎng)基中穩(wěn)定性減小。隨后的FT-IR分析得出金屬離子的含量顯著影響TA與金屬離子的配位作用，從而影響包被納米粒子吸收峰的移動;XPS進(jìn)一步驗證包被納米

13、粒子中金屬離子以及TA的存在，且金屬離子的濃度影響包被納米粒子表面元素含量。
　　細(xì)胞吞噬實驗表明細(xì)胞對zein納米粒子和zein-TA/metal納米粒子的吞噬均呈現(xiàn)時間及濃度依賴性。細(xì)胞對包被納米粒子表現(xiàn)出更快的吞噬速率以及更高的吞噬量。金屬離子種類以及添加量影響細(xì)胞對納米粒子的吞噬效率。通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察短時間細(xì)胞吞噬，細(xì)胞對包被納米粒子粘附性更強(qiáng)，納米粒子進(jìn)入細(xì)胞速率更快。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的吞噬作用是包被納米