趨磁細(xì)菌Magnetospirillum magneticumAMB-1反硝化代謝與DNA損傷修復(fù)體系對磁小體合成及其遺傳穩(wěn)定性的影響研究.pdf

1、趨磁細(xì)菌是一類能在體內(nèi)合成納米級磁性礦物顆粒的兼性厭氧型原核生物，在自然界中分布廣泛。趨磁細(xì)菌大部分分布在α，γ，δ變形菌門和硝化螺菌門，其生長環(huán)境為海水或者淡水的氧化還原交界面處，對生長環(huán)境的氧化還原狀態(tài)要求較高。趨磁細(xì)菌由于能夠通過生物礦化合成磁性顆?！判◇w，所以可感受地磁場，在磁場的作用下進(jìn)行定向游弋。磁小體在趨磁細(xì)菌體內(nèi)排列成鏈狀，而大大增大了菌體的總磁矩。磁小體結(jié)構(gòu)均一，性能穩(wěn)定，分散性好，在生物學(xué)、物理學(xué)、材料學(xué)上有非常

2、廣泛的應(yīng)用。
　　 磁小體作為趨磁細(xì)菌體內(nèi)一類特殊的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，其合成機(jī)制、作用機(jī)制引起了許多學(xué)者的研究興趣。目前已獲得的研究成果表明，磁小體合成是受一系列基因編碼產(chǎn)物的控制而完成的復(fù)雜過程。大致包括鐵源的吸收、運(yùn)輸、運(yùn)輸過程中的代謝以及價(jià)態(tài)變化，磁小體膜的起源和內(nèi)陷，磁小體晶核的生物礦化，以及成熟磁小體的鏈狀排列等等。這些過程互相影響、互相滲透，在不同種類的趨磁細(xì)菌中展示出多樣性和種屬特異性，涉及多種目前未曾全面了解的復(fù)雜生理活

3、動和代謝途徑，且對環(huán)境因素影響敏感。同時(shí)，遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與磁小體合成的有關(guān)基因有明顯的結(jié)構(gòu)組成特征，以基因島的形式存在于趨磁細(xì)菌基因組中，在基因島內(nèi)又可分為幾個(gè)大的基因簇。島內(nèi)基因簇之間以及基因島兩端都存在正向重復(fù)序列，推測這些正向重復(fù)序列通過與某些相關(guān)重組蛋白的相互作用，會導(dǎo)致基因島以一定的頻率進(jìn)行重排，最終引起基因島序列部分或者全部的丟失，從而造成菌體磁小體合成能力的遺傳不穩(wěn)定性。
　　 綜上所述，磁小體合成過程可能會受到

4、菌體多種代謝途徑的影響。通過總結(jié)產(chǎn)磁過程中鐵源的代謝研究成果，我們推測菌體內(nèi)存在的反硝化蛋白組分可能與磁小體合成中鐵價(jià)態(tài)變化過程相偶聯(lián)。在趨磁細(xì)菌模式菌株MS-1(MagnetospirillummagnetotacticumMS-1)體內(nèi)鑒定出了反硝化組分——硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶。通過對兩種酶體外活性的研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽還原酶可能在微好氧條件下以及磁小體合成過程中的能量供應(yīng)方面起作用。而亞硝酸鹽還原酶具有一種與趨磁細(xì)菌相關(guān)的特異

5、活性:二價(jià)鐵:亞硝酸鹽氧化還原酶活性。推測該酶在反硝化途徑中參與了磁小體合成過程中鐵源的氧化還原?；谏鲜鰞煞N酶的初步研究，我們推測趨磁細(xì)菌在以硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)條件下合成菌體所需蛋白質(zhì)進(jìn)行生長的同時(shí)，可偶聯(lián)鐵的氧化還原從而參與或影響磁小體合成過程。但是由于MS-1在厭氧條件下不能以硝酸鹽作為唯一氮源進(jìn)行生長，所以目前還不能確定MS-1體內(nèi)有獨(dú)立的反硝化系統(tǒng)存在。趨磁細(xì)菌AMB-1是趨磁細(xì)菌研究的另一模式菌株，與MS-1不同的是，

6、其能夠在厭氧條件下以硝酸鹽為唯一氮源進(jìn)行生長和產(chǎn)磁。
　　 作為兼性厭氧微生物，趨磁細(xì)菌在氧氣存在條件下進(jìn)行生長，但是氧在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧也同時(shí)會對菌體產(chǎn)生毒害作用，這種作用主要表現(xiàn)在對蛋白、核酸等生物大分子的損傷。我們曾在趨磁細(xì)菌模式菌株，淡水趨磁螺菌AMB-1(MagnetospirillummagneticumAMB-1)中報(bào)道了三個(gè)過氧化還原酶，研究發(fā)現(xiàn)它們在活性氧自由基的清除與磁小體合成能力遺傳穩(wěn)定性的維持方面發(fā)揮

7、重要作用。尤為重要的是這些酶組分的缺失會明顯提高菌體在傳代過程中基因組磁小體島的丟失頻率。因此，趨磁細(xì)菌的氧化抗逆性途徑可能在好氧條件下維持磁小體基因島遺傳穩(wěn)定性方面起作用，但是具體作用機(jī)制并不清楚。在趨磁螺菌MSR-1(Magnetospirillumgryphiswaldense)中，重組酶RecA可以通過重組活性參與磁小體基因島遺傳過程中大片段的丟失，是磁小體島遺傳不穩(wěn)定性的直接原因之一。
　　 本文以淡水趨磁螺菌AMB-

8、1為實(shí)驗(yàn)材料，對兩個(gè)方面進(jìn)行了研究。第一，AMB-1反硝化代謝途徑的分析鑒定以及功能驗(yàn)證。基于對趨磁細(xì)菌體內(nèi)鐵源代謝以及價(jià)態(tài)變化的推測，對AMB-1中反硝化途徑在細(xì)胞能量供應(yīng)和對磁小體合成過程的影響進(jìn)行了探討。第二，針對AMB-1的磁小體合成過程及可能的影響因素，通過轉(zhuǎn)座誘變對AMB-1進(jìn)行突變篩選，探索了磁小體島外與其生理代謝功能相關(guān)的基因在磁小體合成過程中的作用。通過對一個(gè)DNA損傷修復(fù)基因功能失活突變菌株的研究，探討了DNA損傷修

9、復(fù)系統(tǒng)在高氧化壓力的環(huán)境下對AMB-1磁小體基因島以及菌體產(chǎn)磁功能的影響。具體工作內(nèi)容和創(chuàng)新性研究結(jié)果如下:
　　 1.對AMB-1亞硝酸鹽還原酶的編碼基因進(jìn)行預(yù)測和功能分析，探討了該酶在AMB-1反硝化代謝以及磁小體合成過程中的作用。
　　 通過AMB-1基因組的生物信息學(xué)分析，獲得了三個(gè)可能的亞硝酸鹽還原酶編碼基因:amb1395、amb1408、amb4165。在建立體外酶活測定方法的基礎(chǔ)上，對該酶在菌體內(nèi)的活性分

10、布和產(chǎn)酶適宜條件進(jìn)行摸索。結(jié)果表明，亞硝酸鹽還原酶酶活在菌體靜置培養(yǎng)狀態(tài)下的周質(zhì)空間組分中分布較高。對靜置培養(yǎng)的AMB-1周質(zhì)空間組分進(jìn)行分離純化，得到電泳純的活性純蛋白組分。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，該蛋白的編碼基因?yàn)锳MB-1基因組中的amb1395。
　　 通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄分析表明，amb1395在靜置培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄水平明顯高于振蕩培養(yǎng)條件，并且在靜置培養(yǎng)條件下，amb1395的轉(zhuǎn)錄水平在磁小體合成階段明顯升高，說

11、明該基因的表達(dá)產(chǎn)物與磁小體的合成密切相關(guān)。但采用單交換插入策略對amb1395進(jìn)行了功能失活后，功能失活突變株的生理表型卻顯示，菌體在厭氧條件下的生長和磁小體合成與野生型相比均無明顯區(qū)別。這些結(jié)果表明，雖然該酶在趨磁細(xì)菌AMB-1的反硝化代謝及磁小體合成過程中不發(fā)揮主要作用，但可能參與了上述過程。另外，由于該酶的催化底物亞硝酸鹽對菌體有毒性，推測菌體內(nèi)應(yīng)該存在其他途徑組分能夠分解亞硝酸鹽，導(dǎo)致菌體在缺失amb1395之后沒有明顯的表型變

12、化。
　　 2.通過對AMB-1在不同氮源條件下的生長以及對硝酸鹽還原酶基因的預(yù)測分析，確定了反硝化途徑對AMB-1在厭氧條件下的生長及產(chǎn)磁過程的重要性。
　　 AMB-1能夠以硝酸鹽作為唯一氮源進(jìn)行生長。硝酸鹽在體內(nèi)可以通過銨化作用供應(yīng)菌體大分子物質(zhì)的合成。以銨鹽作為唯一氮源的生長實(shí)驗(yàn)表明，菌體在好氧振蕩條件下能夠正常生長，但是在靜置培養(yǎng)或者厭氧條件下生長則受到明顯抑制，這說明銨鹽在靜置或厭氧條件下不能完全代替硝酸鹽。

13、結(jié)合MS-1中的研究，可以推測在AMB-1體內(nèi)可能存在依賴于硝酸鹽的厭氧產(chǎn)能途徑。通過生物信息學(xué)分析，在AMB-1基因組中存在一個(gè)硝酸鹽還原酶編碼基因，amb2690。在建立其體外酶活測定方法的基礎(chǔ)上，對amb2690進(jìn)行了插入失活。發(fā)現(xiàn)硝酸鹽還原酶功能失活突變株在以硝酸鹽作為唯一氮源的有氧培養(yǎng)條件下可正常生長，但不能在厭氧條件下生長和產(chǎn)磁。在以0.3L/min的流速通入空氣的恒定通氧發(fā)酵條件下，菌體能夠在獲得氧氣的基礎(chǔ)上進(jìn)行生長，此時(shí)

14、菌體的鐵吸收水平和磁小體合成水平不受影響。這些結(jié)果說明反硝化途徑可能僅在厭氧條件下作為趨磁細(xì)菌AMB-1生長和磁小體合成過程的能量來源，與磁小體合成過程并沒有特異性的聯(lián)系。當(dāng)有氧氣存在時(shí)，反硝化途徑的功能喪失對菌體生長和產(chǎn)磁過程沒有影響。
　　 3.DNA損傷修復(fù)體系UvrABC在好氧條件下具有維持AMB-1磁小體島遺傳穩(wěn)定性的重要作用。
　　 利用轉(zhuǎn)座子對AMB-1進(jìn)行隨機(jī)插入突變，獲得了一株產(chǎn)磁異常突變株。該突變株的

15、生長與野生型AMB-1沒有明顯差別，但是磁小體合成能力明顯低于野生型。通過分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)該突變株的DNA損傷修復(fù)蛋白復(fù)合體UvrABC的UvrA亞基編碼基因uvrA被轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致其功能失活。進(jìn)一步對uvrA的定點(diǎn)插入失活研究表明，該組分的功能缺失使得菌體在恒定通氧發(fā)酵條件下的產(chǎn)磁能力受到不可逆的損傷。突變株經(jīng)過好氧培養(yǎng)后，保留產(chǎn)磁能力的菌體只占群體的38％左右（野生型AMB-1的產(chǎn)磁菌體達(dá)94％）。同時(shí)，產(chǎn)磁菌體的平均磁小體合成

16、數(shù)目也明顯降低，突變株平均為1-4個(gè)，遠(yuǎn)低于野生型的8-20個(gè)。通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，突變株在好氧條件傳代過程中，磁小體島基因拷貝數(shù)與基因組其他區(qū)段基因拷貝數(shù)的比值明顯降低，突變株子代的磁小體島拷貝數(shù)在經(jīng)20次左右的傳代后僅為突變株原始菌株的20-30％，而同樣條件下的野生型AMB-1子代能保持初始菌株的80％。這表明突變株的磁小體島遺傳穩(wěn)定性在UvrA缺失的情況下明顯下降。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄分析表明，突變株中的重組酶基因recA轉(zhuǎn)錄水平

17、明顯高于野生型AMB-1，達(dá)到AMB-1的11.9倍。recA的插入失活可以降低因UvrA功能失活而引發(fā)的磁小體島區(qū)域的不穩(wěn)定性。因此，uvrA缺失菌中recA轉(zhuǎn)錄活性的上升可能是導(dǎo)致磁小體島遺傳穩(wěn)定性下降的原因。通過以上實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為UvrABC體系的功能喪失會造成趨磁細(xì)菌在好氧條件下DNA隨機(jī)損傷的積累，這種損傷積累到一定水平能夠?qū)е禄赗ecA蛋白的同源重組修復(fù)途徑的激活而引發(fā)基因組磁小體島遺傳穩(wěn)定性的降低。該研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充和