鳀魚蛋白酶解多肽高附加值開發(fā)利用研究.pdf

1、硫酯酶結(jié)構(gòu)域（Thioesterase，TE）在催化線性多肽環(huán)化時具有區(qū)域定向性、化學(xué)定向性和立體定向性的特點。結(jié)合成熟的線性多肽化學(xué)合成法和晶體結(jié)構(gòu)解析，對其底物適用性做了進(jìn)一步研究，并嘗試作用于海洋蛋白水解多肽，希望為以海洋生物活性線性肽環(huán)化為基礎(chǔ)的新型海洋環(huán)肽藥物修飾與開發(fā)提供一條全新的研究思路。
　　我們從前期得到的McyC TE(Microcystin thioesterase，McyC TE)，為進(jìn)一步提高該酶的表達(dá)量

2、，深入研究該酶催化底物的適用性，本研究利用單因素和正交試驗得到最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)時機(jī)2h，誘導(dǎo)劑濃度0.75mmol/L，誘導(dǎo)時間6h，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速210rpm，誘導(dǎo)溫度20℃，使 TE的表達(dá)量由3.5mg/400mL提高至8.86mg/400mL。McyC TE獲得穩(wěn)定大量表達(dá)。
　　基于前期 cilengitide及其類似物的研究，我們設(shè)計了5肽到10肽不同長度的6條肽，進(jìn)行底物適用性研究。結(jié)果表明，McyC TE并不遵循“

3、4n+2/4n原則”，也無肽鏈氨基酸奇偶性的選擇。底物中轉(zhuǎn)角過多不僅不利于環(huán)肽的形成，更可能形成卷曲影響環(huán)化。環(huán)化產(chǎn)物的出現(xiàn)表示無 D型氨基酸亦可通過加入其它位阻較小較靈活或者自帶天然轉(zhuǎn)角的氨基酸弱化肽鏈的剛性，比如 Gly、Pro，使天然產(chǎn)物藥物篩選范圍增大，也為增強(qiáng)天然多肽藥物藥效增加了改良方案。含苯環(huán)的Phe的引入在一定程度上增加了環(huán)化率，可見疏水性氨基酸的加入利于環(huán)化。本次研究更證明了延長多肽鏈長度也可環(huán)化，McyC TE的底物

4、容忍度較大。這些結(jié)論既補(bǔ)充了本課題組的前期研究，也為進(jìn)一步研究McyC TE的催化功能提供了實驗基礎(chǔ)。
　　高純度是McyC TE結(jié)晶的先決條件。經(jīng)3次純化和結(jié)晶條件的篩選優(yōu)化后，在0.1M HEPES pH7.2，1.5M LiSO4條件下得到分辨率為2.84的單晶，參數(shù)為 a=150.748，b=150.748，c=97.516。并將其結(jié)構(gòu)與已解析結(jié)構(gòu)的Srf TE進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)McyC TE結(jié)構(gòu)多出2段序列23-36 YAQ

5、......RPY和154-181 DAF......TYH，這2段序列位于其蓋子區(qū)域。比對結(jié)果中，McyC TE與1JKM/2VSQ中催化三元件（His133/Asp236/Ser106）對應(yīng)各氨基酸的空間位置一致。底物的存在只起到促進(jìn)蛋白結(jié)晶，縮短結(jié)晶時間的作用。借鑒 Srf TE的研究，可以選取已知可以環(huán)化或水解的底物進(jìn)行修飾改造，使其可以被 TE?；遣荒馨l(fā)生隨后的去?；磻?yīng)，利于得到酶與底物相結(jié)合的晶體，進(jìn)行 McyC