幾丁質及高附加值產物酶法生產關鍵技術研究.pdf

1、幾丁質是自然界產量僅次于纖維素的可再生性多聚物。自然界在不斷產生大量幾丁質的同時，微生物也合成了大量能夠降解幾丁質的不同性質的酶。幾丁質在自然界的廣泛分布，意味著能夠分解利用幾丁質及其類似物的微生物也有著廣泛的分布。環(huán)境的多樣性、微生物種類的多樣性為人類篩選不同性質不同要求的幾丁質及其衍生物降解酶提供了可能性。
　　近年來幾丁質及其脫乙?；a物殼聚糖和他們的寡糖，幾丁寡糖和殼寡糖，在諸如食品、制藥、材料科學、微生物學、組織工程、納

2、米材料等很多領域得到廣泛的應用。因此對幾丁質及其相關產物形成巨大的需求，但是目前無論幾丁質的工業(yè)化生產，還是幾丁質脫乙?；a殼聚糖或生產幾丁寡糖、殼寡糖，均以化學方法為主，幾乎都要用到強酸強堿，對環(huán)境造成極大的污染。因此迫切需要開發(fā)新的綠色生產工藝。
　　采用生物學或酶學方法制備幾丁質、殼聚糖及其寡糖具有生產條件溫和可控，對環(huán)境污染少的優(yōu)點，因此是替代化學方法的理想技術，也是目前的研究重點。目前幾丁質的生產主要是從蝦蟹殼中采用鹽

3、酸和氫氧化鈉分別脫除碳酸鈣和蛋白質的辦法，盡管有了一些改進，但是仍需要使用強酸或強堿。另一方面，科研人員從自然界，特別是海洋環(huán)境中已經篩選出很多和幾丁質分解有關的酶，如幾丁質酶（EC3.2.1.14）、幾丁質脫乙?；?CDA;EC3.5.1.41)和殼聚糖酶(EC3.2.1.99)等，但是都普遍都存在酶活力不夠高和酶產量低的問題，因此多處于實驗室階段，尚未應用于工業(yè)生產?；诖?，本研究首先嘗試采用蛋白酶和有機酸分別脫除蝦殼中蛋白質和碳

4、酸鈣的辦法生產幾丁質，然后從與海洋環(huán)境差異巨大的秦嶺山區(qū)不同生境中采集土樣，從中分離新型幾丁質酶和幾丁質脫乙酰酶高產菌株，并對其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化。
　　本研究嘗試采用檸檬酸脫鈣、胃蛋白酶去除蛋白質的工藝從蝦殼中提取幾丁質。首先以灰分的含量為指標，通過單因素試驗確定檸檬酸濃度和處理時間的最佳參數，即濃度12％的檸檬酸溶液處理13小時。該處理得到的幾丁質灰分含量為1.5%，達到工業(yè)級的標準（≤3%），接近食品級標準（≤1%）。

5、胃蛋白酶去除蝦殼中蛋白質的研究中，采用凱氏定氮法測定蛋白質的含量。在考察胃蛋白酶的用量（U/g）、時間（h）、溫度（℃）和pH等單因素基礎上，利用響應面優(yōu)化方法的Box-Behnken設計，以脫除蛋白質的量為響應值，構建了酶的用量、時間和溫度的三維響應曲面模型。ANOVA分析和實際驗證證明該模型準確可靠。通過該模型推測出最佳處理參數為胃蛋白酶使用量為700 U/g、反應溫度36.09℃和反應時間5h，蛋白質的脫除率達到8.47%，占總蛋

6、白質含量的27.89%，。蛋白質去除率偏低，推測與蝦殼幾丁質的微觀結構有關。可以通過先脫鈣再脫蛋白或者進行兩次脫鈣和脫蛋白的方法提高蛋白質的去除效果。
　　優(yōu)良的菌種是微生物發(fā)酵的基礎和關鍵，一直是微生物降解幾丁質研究的重要內容之一。但目前篩選到的幾丁質酶和幾丁質脫乙酰酶生產菌株均存在酶活力不夠高和穩(wěn)定性差的問題，因此仍處于實驗室階段，距離工業(yè)化應用還有很大的差距。本研究從秦嶺山脈采集土壤樣品，經過富集培養(yǎng)后，從中篩選幾丁質酶和幾

7、丁質脫乙酰酶高產菌株。幾丁質酶高產菌株的初篩選是利用以膠體幾丁質為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從中挑出100株產生較大透明圈的菌株，根據D值（透明圈與菌落直徑的比值）大小篩選出20株產酶能力較強的菌株。復篩選采用液體搖瓶發(fā)酵，DNS法測定酶活力的方法篩選出產酶能力最高的3株細菌，編號分別為Z4、F9和D5-23。其中菌株 Z4的酶活最大，達到了2.3 U/mL。菌體形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析表明菌株Z4屬于微桿菌屬(Micro

8、bacterium)。通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，其產酶能力得到極大的提高。首先以發(fā)酵液中的酶活為指標，通過單因素實驗確定其產幾丁質酶的最佳碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母膏。在此基礎上采用Plackett-Burman設計實驗確定初始培養(yǎng)基中影響酶產量的主要因素分別是葡萄糖、酵母膏和培養(yǎng)基pH，經過爬坡實驗和Box-Behnken設計對培養(yǎng)基組成進行響應面優(yōu)化，最終確定培養(yǎng)基主要因素的最佳組合為葡萄糖為0.314g/100mL，酵母膏

9、為0.308g/100mL，培養(yǎng)基 pH為7.41。在該培養(yǎng)基條件下，酶產量提高了78%。在單因素實驗的基礎上，對影響發(fā)酵的幾個因素，溫度(℃)、接種量(%)、裝液量（mL）和初始pH進行四因素三水平正交試驗確定Z4產酶的最佳發(fā)酵條件。結果表明溫度對產酶的影響最大，其次是pH、接種量和裝液量。四個因素的最佳組合為培養(yǎng)溫度28℃，起始pH7，裝液量60mL,接種量6%。在該條件下，酶產量提高了79.6%。
　　在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，還

10、發(fā)現Z4菌株幾丁質酶合成存在多態(tài)現象，因此有必要對其幾丁質酶基因的表達調控進行深入研究。此外將幾丁質酶基因克隆到高效表達載體中使其進行異源表達，這樣可以去除供體菌自身對產幾丁質酶的代謝控制，也可以提高酶產量。為此根據GENE BANK中唯一的一個微桿菌屬幾丁質酶基因序列和幾丁質酶催化域氨基酸保守序列設計引物，對其保守區(qū)域進行 PCR擴增和測序，獲得催化域192bp的一段DNA序列。對該序列的生物信息學分析表明該基因為幾丁質酶基因，屬于糖

11、苷水解酶18家族。該序列的獲得為進一步克隆其整個基因創(chuàng)造了條件，為進一步基因的異源表達和分子改造奠定了基礎。
　　CDA高產菌株的篩選首先是通過變色圈法篩選出產酶能力較強的菌株，再通過比較發(fā)酵液中的酶活，篩選出產酶能力最強的菌株，編號為F2-7-3。根據菌體的形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，確定該菌株屬于放線菌門（Actinobacteria）的紅球菌屬（Rhodococcus）。酶學性質的研究表明該酶催化反應的最適pH為7.

12、0、最適溫度為50℃。為提高幾丁質脫乙酰基酶的產量，對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，首先通過單因素實驗確定產酶培養(yǎng)基最佳碳源和氮源分別為蔗糖和酵母膏，通過正交試驗確定初始培養(yǎng)基中對產酶影響最大的無機鹽是KH2PO4。據此，以發(fā)酵液酶活為響應值，采用Box—Behnken設計構建了培養(yǎng)基影響產酶的三個主要因素，蔗糖、酵母膏和KH2PO4的響應曲面模型。該模型預測三個因素的最佳組合為：蔗糖7g/L；酵母膏9.15g/L；KH2PO4