CDX2基因過表達對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中MUC2蛋白的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶并穩(wěn)定表達尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2（CDX2）基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），為大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的基因治療提供工具；探討CDX2基因過表達對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中MUC2蛋白的作用；
　　方法:
　　1、CDX2基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　設(shè)計CDX2引物，采用PCR擴增CDX2基因片段;通過In-Fusion技術(shù)將目的基因片段連接到線性質(zhì)粒載體中，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，進行陽性克隆篩選及

2、基因測序。將重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進行慢病毒包裝、濃縮，并用熒光法進行滴度測定。
　　2、大鼠BMSCs的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及鑒定
　　采用骨髓貼壁法體外分離并培養(yǎng)雄性 Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FACS）檢測細(xì)胞免疫表型。將攜帶CDX2基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用RT-PCR及Western blot等技術(shù)檢測干細(xì)胞中CDX2 mRNA及蛋白的表達水平。
　　3、大鼠UC模型的誘導(dǎo)

3、及分組處理
　　采用5%2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TNBS)/無水乙醇化學(xué)法誘導(dǎo)雌性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎（UC）疾病模型；再次采用FACS檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞免疫表型；分別將1ml生鹽水（NS，B組）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs，C組）、空載慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（LV-BMSCs，D組）、攜帶CDX2的慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（CDX2-BMSCs，E組）經(jīng)鼠尾靜脈注射移植到UC模型大鼠體內(nèi)，另外設(shè)未

4、處理的大鼠為正常對照組（A組）。
　　4、干預(yù)后不同組別大鼠量化評分
　　對不同組別大鼠的急性疾病活動指數(shù)（DAI）評分；取移植治療后7天的大鼠結(jié)腸組織肉眼及光鏡下（HE染色）觀察其損傷變化，并對其進行結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index，CMDI)、組織損傷指數(shù)（The scoring criteria of tissue damage index，TDI）量化評分。

5、>　　5、制備組織冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察增強綠色熒光蛋白（EGFP）的表達情況。
　　6、檢測大鼠結(jié)腸組織SRY、CDX2、MUC2的表達
　　經(jīng) PCR技術(shù)檢測大鼠結(jié)腸組織內(nèi)是否表達雄性鼠特異性的 SRY基因，采取RT-PCR及 Western Blot技術(shù)檢測不同組 CDX2 mRNA和蛋白的表達情況；用Western Blot技術(shù)檢測不同組別MUC2蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、PCR、DNA測

6、序及WB檢測結(jié)果表明成功構(gòu)建重組Ubi-CDX2-MCS-3FLAG-CMV-EGFP慢病毒載體，測定滴度為2×108TU/ml。
　　2、FACS鑒定結(jié)果顯示，大鼠BMSCs表達CD29、CD73、CD90，而不表達CD34和CD45，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型，成功完成大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示CDX2基因轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs并能穩(wěn)定表達，成功構(gòu)建攜帶CDX2基因的BMSC

7、s系統(tǒng)。
　　3、給予5%TNBS/無水乙醇灌腸處理后，大鼠出現(xiàn)厭食、扎堆、體重下降、腹瀉等結(jié)腸炎癥狀，在第3天各實驗組DAI評分較正常組明顯增高，但組間無顯著差異（F=0.39,P>0.05）；FSCS結(jié)果提示慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞依然表現(xiàn)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。
　　4、給予不同處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后第7天，E組大鼠DAI、CMDI、TDI評分明顯低于B、C、D組（P<0.05）,C、D兩組分別低于B組（P<

8、0.05），而C、D兩組間無明顯差異（P>0.05）。
　　5、熒光顯微鏡下觀察各組冰凍切片發(fā)現(xiàn)只有 D、E兩組可見大量熒光，其他組均無熒光表達，說明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。
　　6、SRY基因的PCR定性檢測發(fā)現(xiàn)C、D、E三組在213bp處可見電泳條帶，說明雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功移植到大鼠體內(nèi)并歸巢到結(jié)腸組織。通過QRT-PCR和WB技術(shù)定量檢測大鼠結(jié)腸組織CDX2 mRNA、CDX2蛋白和MUC2蛋白發(fā)現(xiàn)，E組較B、C、

9、D組表達增加（P<0.05），B組表達量最低，明顯低于其他各組（P<0.05）,C、D兩組間無差異（P>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達CDX2基因的雄性大鼠BMSCs并移植到雌性大鼠體內(nèi)；
　　2、采用5%TNBS/無水乙醇成功誘導(dǎo)出大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，為進一步的實驗奠定基礎(chǔ)；
　　3、首次通過慢病毒載體借助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組作為運載細(xì)胞將目的基因CDX2轉(zhuǎn)染到大鼠體內(nèi)過表達，探討了該基