超小雙親分子囊泡自組裝形成與機(jī)制研究.pdf

1、分子自組裝是眾多生物生命活動(dòng)和生物學(xué)功能得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)，自然界環(huán)境中的生物體就是復(fù)雜的自組裝體系，也是自然界中普遍存在的現(xiàn)象，多年來一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。分子自組裝。自2013年關(guān)于細(xì)胞囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)被授予諾貝爾獎(jiǎng)，對(duì)于囊泡的研究越發(fā)引起科學(xué)家的興趣。眾所周知，細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙層和膜蛋白組成，生物膜的結(jié)構(gòu)直接影響著細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的輸運(yùn)，通過囊泡與細(xì)胞膜融合可精確控制分子傳遞，囊泡精確控釋作用在醫(yī)療、食品、生命科學(xué)受到廣泛關(guān)注。<

2、br>　　近年來，自組裝行為的研究主要集中在材料科學(xué)、藥物運(yùn)載體系、生物工程等科學(xué)領(lǐng)域的研究，如材料科學(xué)中的高分子組裝體;傳統(tǒng)脂質(zhì)體形成囊泡包埋藥物作為緩釋載體等等。生命科學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了分子間相互作用的研究，在生物體內(nèi)，許多分子是以高度有序的方式組合的，才能具有一定的功能。例如，細(xì)胞膜中磷脂與膽固醇形成高度有序排列體是生物新陳代謝過程中必不可少的部分。細(xì)胞膜既通過選擇性滲透來調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞內(nèi)、外的物質(zhì)交換外，還能由膜包圍形成膜

3、泡實(shí)現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，如小腸上皮細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。細(xì)胞分泌到胞外環(huán)境中囊泡直徑約為100-1000nm，富含磷酸甘油酯、飽和脂肪酸?；?、膽固醇等，攜帶了特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA和DNA，在細(xì)胞間傳遞分子信號(hào)。囊泡與通道蛋白、膜磷脂相互作用改變膜磷脂的結(jié)構(gòu)與流動(dòng)性，可能會(huì)造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性、屏障功能、細(xì)胞的分化成熟程度。蛋白質(zhì)以其帶電的氨基酸或基團(tuán)與磷脂極性頭相互作用，同時(shí)，細(xì)胞膜脂肪酸的組成對(duì)膜的流動(dòng)性起決定作用，胞內(nèi)正電荷與負(fù)電荷

4、形成誘導(dǎo)電場，外源性電場可以影響膜上的離子泵狀態(tài)、膜力學(xué)特性以及結(jié)合水分子等進(jìn)而影響細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞膜電位的變化。最近，Science及生物領(lǐng)域雜志接連刊登有關(guān)囊泡的文章，表明了囊泡結(jié)構(gòu)在生理活動(dòng)中的重要作用正得到加強(qiáng)。
　　目前，關(guān)于國際上囊泡的研究熱點(diǎn)主要集中在兩個(gè)方面:一是研究此類單鏈表面活性劑聚集結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及受pH誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)和理論;利用非共價(jià)相互作用，通過多層次的自組裝過程產(chǎn)生大量的生物材料。二是以囊泡作為原細(xì)胞模

5、型，研究其從單體向球體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變過程。囊泡最初的研究對(duì)象主要是飽和或不飽和長鏈脂肪酸，如油酸、亞油酸。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)生物代謝有機(jī)小分子也能自組裝形成囊泡，如脂肪酸、天然氨基酸等單鏈小分子也可以通過改變末端羧基的質(zhì)子化/離子化形成聚集體。另外，具有特定結(jié)構(gòu)的超小雙親分子，如直鏈非天然氨基酸也能通過分子間非共價(jià)鍵的作用下，自發(fā)形成有序、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的聚集體。特別在生物體內(nèi)，由代謝或膳食攝取的脂肪酸、氨基酸等超小雙親分子廣泛存在，它們?cè)谝欢l件

6、下也能自組裝形成單分子層囊泡結(jié)構(gòu)。同時(shí)，脂肪酸、氨基酸等超小雙親分子單分子形成的囊泡結(jié)構(gòu)與細(xì)胞分泌到胞外環(huán)境中的脂質(zhì)微囊泡和凋亡小體具有相仿的中空球形結(jié)構(gòu)，直徑都在200nm范圍，所以通過對(duì)脂肪酸、氨基酸等超小雙親分子自組裝形成條件與機(jī)制研究，將有利于我們深入了解生物體內(nèi)自組裝與生命活動(dòng)相關(guān)的現(xiàn)象。
　　但是，對(duì)于小分子自組裝，特別是超小雙親分子自組裝行為的研究則末見報(bào)道。過去，一般認(rèn)為鏈長Cn＜8的單鏈小分子不易自組裝形成穩(wěn)定囊

7、泡結(jié)構(gòu)。我們通過不同鏈長單鏈雙親分子在水溶液中形成聚集形態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酸鏈長在5＜Cn＜8的超小雙親分子也能在一定條件下自組裝形成穩(wěn)定的囊泡結(jié)構(gòu)。在實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了最短形成囊泡的脂肪酸鏈長的基礎(chǔ)上，集中研究了直鏈最短飽和脂肪酸、直鏈非天然氨基酸、天然氨基酸等超小雙親分子在水相中進(jìn)行自聚合形成囊泡的結(jié)構(gòu)，對(duì)其組裝體的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)、形成機(jī)理等問題進(jìn)行深入的探討。實(shí)驗(yàn)利用紅外光譜(FT-IR)、紫外可見光譜(UV-vis)、激光粒度儀、激光共聚

8、焦顯微鏡(CLSM)、透射電子顯微鏡(TEM)和低溫透射電子顯微鏡(Cryo-TEM)對(duì)自組裝性質(zhì)與形貌特征進(jìn)行跟蹤表征;采用Zetapals電位分析儀測(cè)試組裝體的粒徑及分散系數(shù)。同時(shí)，設(shè)計(jì)溶液pH變化、鏈長關(guān)系、溶劑-界面等多種自組裝調(diào)控方法，考察濃度、鏈長效應(yīng)、pH等對(duì)生物體代謝中間產(chǎn)物超小雙親分子在溶液中自組裝行為的調(diào)控機(jī)制。
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求開發(fā)了一套基于熒光探針囊泡與細(xì)胞相互作用的研究方法，采用膜電位敏感熒光探針Di-8

9、-ANEPPS標(biāo)記細(xì)胞膜表面，熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱反映了細(xì)胞膜電位的變化，當(dāng)細(xì)胞被極化時(shí)膜電位增加，膜表面Di-8-ANEPPS熒光強(qiáng)度增強(qiáng);反之，Di-8-ANEPPS熒光強(qiáng)度降低，膜電位降低。通過熒光顯微鏡觀察Di-8-ANEPPS標(biāo)記的細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度的變化，可以有效、連續(xù)測(cè)定細(xì)胞的膜電位變化。這種方法最大的特點(diǎn)在于:對(duì)被測(cè)細(xì)胞沒有損傷，實(shí)現(xiàn)無損、精確測(cè)量，快捷、動(dòng)態(tài)地反應(yīng)出細(xì)胞膜隨環(huán)境變化引起的膜電位極化變化趨勢(shì)，可以有效反映出微囊泡與

10、細(xì)胞相互作用引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理變化。
　　課題通過研究超小雙親分子的有序自組裝，分析超小雙親分子有序組裝體的形成及自組裝調(diào)控進(jìn)程，確定合理的自組裝條件，從生物物理化學(xué)角度探討超小雙親分子自組裝機(jī)制，有助于構(gòu)建多種尺度和形貌的超小雙親分子有序自組裝體。對(duì)于超小雙親分子囊泡聚集現(xiàn)象及其內(nèi)在機(jī)制的探索將有助于加深人們對(duì)相關(guān)生命過程的理解和認(rèn)識(shí)。從簡單的模型膜入手，試圖揭示與生物膜功能相對(duì)應(yīng)的物理和化學(xué)規(guī)律，這將有利于我們對(duì)超小雙親分子的