黃素類熒光探針與生物分子相互作用機(jī)理研究.pdf

1、熒光探針方法由于其極高的靈敏度，對(duì)環(huán)境敏感性，對(duì)樣品非破壞性和提供多方面的信息量等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為研究生物分子的主要方法之一。本文應(yīng)用熒光光譜、紫外光譜和激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨瞬態(tài)吸收光譜法研究生物活性分子與熒光探針之間相互作用，闡明生物分子的光物理和光化學(xué)反應(yīng)過程。本文的工作分為以下兩個(gè)部分：第一部分，兩種熒光探針二甲基異咯嗪(LC)和9-(2-羥乙基)黃素(HEF)的紫外光譜和熒光光譜顯示，它們具有很強(qiáng)的紫外吸收和熒光發(fā)射，可以

2、作為很有潛力的核酸內(nèi)源性熒光探針來進(jìn)行核酸及其前體的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)研究。實(shí)驗(yàn)表明，核酸堿基(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤)、核苷(鳥苷、脫氧鳥苷)以及核酸(小牛胸腺DNA、鮭魚精DNA、酵母RNA)對(duì)LC或HEF探針的熒光均有很強(qiáng)的猝滅作用，符合Stern-Volmer線性方程。所測(cè)得熒光猝滅速率常數(shù)的數(shù)值處于擴(kuò)散控制范圍(109-1011 M-1S-1)，表明LC或HEF與核酸及其前體的相互作用具有電子轉(zhuǎn)移(ET)的性質(zhì)。

3、熱力學(xué)的理論分析也說明了核酸及其前體與探針LC或HEF發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的可行性。 應(yīng)用紫外光譜和熒光光譜方法探討了兩種探針LC和HEF與核酸之間的作用模式與機(jī)理。加入ctDNA后探針LC和HEF的紫外光譜呈現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)，并有等光點(diǎn)存在。在與溴化乙錠EB雙熒光探針競爭中，LC和HEF均使EB-ctDNA絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度明顯減弱。加入探針LC和HEF后ctDNA的融化溫度升高。隨探針LC和HEF濃度增加，ssDNA的粘

4、度變大。LC與ctDNA結(jié)合時(shí)，LC的熒光光譜偏振度增大等。這些特征都顯示了探針LC和HEF與DNA之間的作用模式包括探針嵌入DNA堿基對(duì)和弱的氫鍵作用。由紫外光譜和熒光滴定法分別測(cè)得兩種探針LC和HEF與DNA的結(jié)合常數(shù)均在105 mol-1·L數(shù)量級(jí)，說明了兩種探針均與DNA發(fā)生強(qiáng)的相互作用，同時(shí)也說明測(cè)量方法的可靠性。第二部分，應(yīng)用激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨激光閃光光解技術(shù)，研究了探針LC和HEF在水溶液中的瞬態(tài)吸收光譜和動(dòng)力學(xué)

5、，分析了特征吸收峰的歸屬?？疾霯C和HEF三重態(tài)的衰減動(dòng)力學(xué)，測(cè)得二者的激發(fā)三重態(tài)的固有壽命以及自猝滅速率常數(shù)，提出了自猝滅電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)機(jī)理。系統(tǒng)研究了猝滅劑三苯胺、氨基酸及二肽(色氨酸Trp、色氨酸苯甲酸酯Trp-Phe、4-甲硫氨酸MET、4-甲硫氨酸苯甲酸酯Met-Phe)、核苷(鳥苷、脫氧鳥苷)以及核酸(小牛胸腺ctDNA、鮭魚精ssDNA、酵母yRNA、雙股寡聚核苷酸)與LC，HEF激發(fā)態(tài)的反應(yīng)過程、瞬態(tài)中間體和微

6、觀機(jī)理。通過上述猝滅劑與3LC，3HEF的瞬態(tài)吸收光譜和猝滅反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，闡明了猝滅反應(yīng)所涉及的主要過程為光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移過程。熱力學(xué)的理論分析也說明了各種猝滅劑猝滅3LC和3HEF的機(jī)理是光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移過程。設(shè)計(jì)含有不同鳥嘌呤序列的寡聚核苷酸鏈(ON)，探討不同序列的ON與光敏劑3LC，3HEF發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的給電子能力，結(jié)果表明，隨著ON中相鄰鳥嘌呤堿基數(shù)目的增多，ON的給電子能力逐漸增強(qiáng)。關(guān)鍵詞：二甲基異咯嗪(