生物分子探針與腫瘤細胞相互作用機制的光譜-電化學研究.pdf

1、腫瘤的早期檢測對挽救生命至關重要，能夠明顯提高患者的生存率。發(fā)展簡便易行、特異性高、敏感性強的腫瘤檢測與診斷技術，已成為一個亟待解決的難題。在本論文的研究工作中，我們研究和拓展了新型二茂鐵碳硼烷衍生物(FcCB)的生物學效用，并進一步將其用作生物分子探針，實現(xiàn)了腫瘤細胞的高靈敏識別與檢測。與此同時，我們采用液滴電化學系統(tǒng)和光譜學手段研究了FcCB的電化學及其光譜學性質(zhì)，推理了其氧化還原機制。進一步地，采用多種電化學和光譜學方法研究了Fc

2、CB與生物大分子的相互作用過程，計算其結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)。在此基礎上，將該生物分子探針用于白血病細胞的識別與檢測，并進行了臨床樣本的分析。同時，論文進行了基于電化學-表面等離子體激元共振技術(SPR)的細胞傳感研究，制備了氨基苯硼酸原位修飾的SPR芯片，用于腫瘤細胞的傳感與分析;使用原位電化學-SPR技術動態(tài)監(jiān)測了生物分子探針與腫瘤細胞相互作用過程，并用于細胞活性的評價。
　　具體內(nèi)容如下:
　　1)碳硼烷衍生物的光電性質(zhì)

3、及其與生物大分子相互作用研究
　　首先構建了液滴電化學系統(tǒng)，以減少樣本的用量，提高檢測效率。液滴電化學系統(tǒng)由電化學單元、XYZ三軸滑動平臺及成像系統(tǒng)組成。使用液滴電化學系統(tǒng)及光譜方法研究了FcCB的氧化還原性質(zhì)。FcCB具有1對可逆的氧化還原峰和1個不可逆的氧化還原峰，分別歸屬于二茂鐵基團和環(huán)戊烯結(jié)構;FcCB的電化學性質(zhì)與電解質(zhì)的pH值密切相關，電解質(zhì)溶液的pH值為3.0～8.0時，峰電位與pH值呈線性關系，其斜率值接近59 m

4、V/pH單位，說明反應過程中質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)目和電子轉(zhuǎn)移數(shù)目相等;電化學及光譜結(jié)果表明FcCB的氧化還原過程涉及兩步單電子-單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的氧化還原反應。
　　電化學、紫外光譜及熒光光譜結(jié)果表明FcCB與血紅蛋白具有較強的相互作用，結(jié)合常數(shù)在104 M-1數(shù)量級;FcCB能夠猝滅血紅蛋白的熒光，為動態(tài)和靜態(tài)混合猝滅機制，且靜態(tài)猝滅常數(shù)和動態(tài)猝滅常數(shù)接近;當FcCB和血紅蛋白濃度比小于2時，結(jié)合位點數(shù)為1，結(jié)合常數(shù)為5.67×103 M-1，

5、而FcCB和血紅蛋白濃度比大于2時，結(jié)合位點數(shù)為2，結(jié)合常數(shù)為1.06×108 M-1; FcCB能夠結(jié)合到血紅蛋白的疏水區(qū)域，進而改變血紅蛋白的構象，使其三級結(jié)構變得疏松甚至解聚。
　　2)FcCB生物分子探針在腫瘤細胞識別中的應用研究
　　拓展了碳硼烷衍生物FcCB的生物醫(yī)學應用，將其用作生物分子探針，用于腫瘤細胞的識別與檢測及臨床樣本分析。與不可逆峰相比，F(xiàn)cCB的可逆峰具有更寬的線性范圍，更低的檢出限，使其在生物傳感

6、檢測中的應用成為可能。研究表明，F(xiàn)cCB與正常及病變的白細胞作用后，其電化學響應發(fā)生特異性改變。正常組的峰電位相比FcCB本身向負電位方向移動，而白血病組的峰電位則向正電位方向移動。因此其峰電位可以用作細胞識別與檢測的特征信號。多種統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示正常組和白血病組的峰電位位移具有顯著性差異，因此FcCB可以用于臨床樣本的特異性識別與檢測。本方法為腫瘤的早期診斷和臨床療效監(jiān)控等方面提供了新的方法與技術手段，具有潛在而重要的應用前景。

7、r>　　3)基于氨基苯硼酸原位修飾的SPR生物傳感研究
　　制備了氨基苯硼酸原位修飾的SPR芯片，接觸角和紅外光譜結(jié)果進一步表明氨基苯硼酸修飾到了芯片表面。氨基苯硼酸修飾的SPR芯片對葡萄糖分子具有良好的檢測靈敏度，檢出限為0.512mM，同時能夠進行再生進而重復使用。進一步地，氨基苯硼酸修飾的SPR芯片可以用于腫瘤細胞的傳感與檢測。隨著時間的增加，HepG2細胞吸附到芯片表面，SPR響應逐漸增大，最后趨于穩(wěn)定，達到平臺。隨著細胞

8、濃度的增加，SPR響應達到平臺所用的時間逐漸降低，且參比通道所用時間大與樣品通道。同時，HepG2細胞在樣品通道上的SPR響應明顯高于參比通道，樣品通道的檢測靈敏度遠高于參比通道。在5×103～1×106細胞/mL濃度范圍內(nèi)與細胞的數(shù)量的對數(shù)值呈正相關，樣品通道對HepG2細胞的檢測限低于1000細胞/mL。這種非標記、實時、快速的檢測方法對腫瘤細胞的傳感與檢測提供了新的分析手段。
　　4)基于電化學-SPR技術的生物活性分子和腫

9、瘤細胞相互作用的研究
　　采用了電化學-SPR聯(lián)用方法評估了柔紅霉素處理后HepG2細胞的活性。首先優(yōu)化了細胞芯片的制備條件，進而在實時記錄SPR響應的同時，采集細胞外柔紅霉素的電化學信號。SPR響應來源于SPR芯片表面吸附細胞形態(tài)和質(zhì)量以及液體環(huán)境折射率等因素的變化，電化學信號則歸屬于細胞外殘留、未被細胞吸收的柔紅霉素分子。實驗結(jié)果表明，細胞的SPR響應及柔紅霉素的電化學信號均是濃度和時間依賴的。隨著柔紅霉素濃度和孵育時間的增加

10、，細胞凋亡率增加，有更多的細胞從SPR芯片上脫落，導致芯片覆蓋率及芯片表面的折射率降低，因此SPR響應逐漸降低。同時，隨著孵育時間的增加，細胞吸收培養(yǎng)基中的柔紅霉素分子，使得細胞外殘留的柔紅霉素含量減小，因此其電化學信號發(fā)生降低;另一方面，細胞凋亡后釋放部分柔紅霉素分子到培養(yǎng)基中，因此隨后的電化學信號略有增加。與此同時，MTT和顯微學結(jié)果驗證了電化學-SPR的結(jié)果。進一步地，SPR響應和細胞存活率呈良好的線性關系，可以用于評語細胞活性。