光催化交聯(lián)法構(gòu)建生物活性界面.pdf

1、生物活性界面是生物芯片、生物傳感器、固定化酶反應(yīng)器以及免疫親和色譜等檢測、分析、催化、分離純化等技術(shù)手段得以實現(xiàn)的基礎(chǔ)，實現(xiàn)生物分子在載體表面高活性、高載量的固載，是進(jìn)一步優(yōu)化、提高各技術(shù)手段的前提。目前，化學(xué)共價法是構(gòu)建生物活性界面的主流方法，雖可實現(xiàn)生物分子在載體表面的牢固結(jié)合，但是常規(guī)的化學(xué)共價法存在反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)時間長等諸多問題，常導(dǎo)致生物分子變性、失活從而失去其生理功能。本論文針對常規(guī)化學(xué)共價法在固載生物活性分子方面存在的

2、不足，提出了一種基于酚基光催化交聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建蛋白質(zhì)分子活性界面的方法。該反應(yīng)反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短，可最大程度的維持生物分子構(gòu)象的穩(wěn)定，保持生物分子的活性。本論文的研究內(nèi)容包括以下幾個方面：
　?。?）驗證光催化法酚基表面固載活性蛋白的可行性和普適性：通過熒光檢測的方法驗證了光催化反應(yīng)可實現(xiàn)牛血清白蛋白（BSA）在瓊脂糖凝膠酚羥基表面的有效固載，固載反應(yīng)可在5s內(nèi)完成，且溶液條件溫和。同樣的方法也可實現(xiàn)生物素化的人免疫球蛋白 G（

3、hIgG）在 Whatman濾紙酚羥基表面的固載。酶活測定實驗表明光催化反應(yīng)后的脂肪酶仍能保持80%以上的酶活。同時，利用該方法在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上固載的基因重組蛋白A可實現(xiàn)hIgG的有效吸附和洗脫，吸附量和洗脫率可分別達(dá)到13 mg/mL gel和90%以上，同時對BSA的非特異性吸附較低，低于0.6 mg/mL gel。進(jìn)一步實驗采用該方法實現(xiàn)了親和素—生物素化抗EpCAM抗體在玻璃片表面的固載，該生物活性界面在1 h和3 h內(nèi)對MC

4、F-7系細(xì)胞的捕獲量達(dá)近10000個/cm2和25000個/cm2玻璃片，而常規(guī)法構(gòu)建的親和素—生物素化抗EpCAM抗體界面在1 h和3 h內(nèi)的捕獲量僅約為200個/cm2和15000個/cm2玻璃片，遠(yuǎn)低于前者的捕獲效果。上述結(jié)果充分證實了酚基光催化偶聯(lián)法對于在不同材料界面固載活性蛋白質(zhì)的有效性，且方法簡單、反應(yīng)快速、條件溫和，對固載的蛋白質(zhì)活性影響較小。
　?。?）酚基光催化交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理和影響因素的探究：延長光照時間可提高蛋白

5、質(zhì)在瓊脂糖凝膠酚羥基表面的固載量，但固載量提高的程度存在顯著性差異，當(dāng)光照時間從2 s延長到15 s時，hIgG（10 mg/mL）的固載量可從7.80 mg/mL gel增長到30 mg/mL，而同濃度的BSA的固載量僅從11.47 mg/mL gel增長到13.82 mg/mL gel。提高蛋白質(zhì)初始濃度是提高蛋白質(zhì)固載量的重要手段，在10 s的光照時間下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度從2 mg/mL增加到10 mg/mL，BSA的固載量從3.6

6、4 mg/mL gel增加到12.81 mg/mL gel，hIgG的固載量也從5.47 mg/mL gel提高到了20.74 mg/mL gel。蛋白質(zhì)種類對光催化交聯(lián)反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在較低分子量的蛋白質(zhì)、含有較多高反應(yīng)活性的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)以及含有較多β-折疊片的蛋白質(zhì)更加容易參與光催化交聯(lián)反應(yīng)。通過考察β-巰基乙醇和乙醇胺對BSA固載量的影響以及硅片酚羥基表面分別偶聯(lián)β-巰基乙醇和乙醇胺后的X射線光電子能譜分析（XPS），證實

7、氨基和巰基同樣是在酚羥基鄰位形成共價鍵的方式參與到光催化交聯(lián)反應(yīng)中。
　?。?）光催化交聯(lián)構(gòu)建蛋白質(zhì)凝膠的研究：以纖維蛋白原溶液為原料，通過光催化交聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建了以纖維蛋白原凝膠為載體的固定化脂肪酶體系，該體系中纖維蛋白原凝膠的儲能模量（G’）和損耗模量（G’’）可分別達(dá)到了800 Pa和100 Pa，是良好的載體，固定化脂肪酶的固載量可達(dá)30%，酶活可保持45%，高于文獻(xiàn)報道的其它共價法制備的固定化酶30%酶活保持率，而在連續(xù)使用

8、5次之后，酶活并未出現(xiàn)顯著性下降，具備良好的重復(fù)使用性能。同樣，利用該方法在硅片表面制備了以纖維蛋白原為基底的蛋白A功能膜，通過 ELISA法測得該活性界面的吸光值可達(dá)到0.6119，為陰性對照組的2.64倍，而環(huán)氧法構(gòu)建的蛋白A功能界面，吸光值與陰性對照組無顯著性差異，表明光催化法較之于環(huán)氧法具有更高的應(yīng)用價值。
　　總之，本論文提出的光催化交聯(lián)法可實現(xiàn)功能蛋白質(zhì)活性界面的構(gòu)建，而且較之于常規(guī)法構(gòu)建的蛋白質(zhì)活性界面，具備更加優(yōu)良