改性環(huán)氧基樹(shù)脂為載體的7α-和7β-HSDH的固定化研究.pdf

1、?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic acid,TUDCA）是熊膽粉的主要及特有活性成分?；谥卮笮滤巹?chuàng)制項(xiàng)目“體外培育熊膽粉關(guān)鍵技術(shù)及臨床前研究”2014ZX09301306-007的科研項(xiàng)目，課題組前期采用戊二醛活化的殼聚糖微球?yàn)檩d體，將?；蛆Z去氧膽酸（Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA）在體外催化轉(zhuǎn)化為TUDCA的關(guān)鍵酶，即7α-羥基類固醇脫氫酶（7α-hydroxysteroid

2、 dehydrogenase,7α-HSDH）和7β-羥基類固醇脫氫酶（7β-hydroxysteroid dehydrogenase,7β-HSDH）進(jìn)行固定化，以解決游離酶不利于工業(yè)生產(chǎn)的問(wèn)題。但在連續(xù)反應(yīng)操作的過(guò)程中，大量殼聚糖微球因其較差的機(jī)械強(qiáng)度而發(fā)生破裂，難以滿足產(chǎn)業(yè)化的需求。因此選擇新的性能優(yōu)良且機(jī)械強(qiáng)度高的固定化酶載體是本課題的主要出發(fā)點(diǎn)。
　　環(huán)氧基樹(shù)脂因其較高的機(jī)械強(qiáng)度，良好的物理及化學(xué)性能，而被廣泛用作固定化

3、酶的載體材料。但由于環(huán)氧基樹(shù)脂得到的固定化酶存在酶活較低的情況，因此本課題對(duì)環(huán)氧基樹(shù)脂進(jìn)行了氨基修飾，得到具有雙官能團(tuán)的氨基-環(huán)氧基樹(shù)脂，并以此作為載體材料，進(jìn)行7α-HSDH和7β-HSDH的固定化研究，并進(jìn)一步研究了雙酶共固定體系對(duì)TCDCA的轉(zhuǎn)化。
　　以EDA修飾環(huán)氧基樹(shù)脂得到的氨基-環(huán)氧基樹(shù)脂為載體，進(jìn)行7α-HSDH和7β-HSDH的固定化，載體的機(jī)械強(qiáng)度較高，且得到的固定化酶的酶活較高、連續(xù)操作性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，利于產(chǎn)

4、業(yè)化生產(chǎn)。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容如下：
　?、侔被?環(huán)氧基樹(shù)脂的制備與表征。以環(huán)氧基樹(shù)脂為載體，采用乙二胺（EDA）修飾的方法對(duì)環(huán)氧基樹(shù)脂進(jìn)行氨基化修飾，并通過(guò)紅外光譜的方法驗(yàn)證了氨基-環(huán)氧基團(tuán)的成功引入，獲得具有雙官能基團(tuán)的氨基-環(huán)氧基樹(shù)脂。掃描電鏡結(jié)果顯示修飾前后載體的形態(tài)未發(fā)生明顯改變；用滴定法測(cè)定氨基修飾密度，在6h時(shí)達(dá)到修飾平衡；Zeta電位表明在pH2～10范圍內(nèi)，載體表面帶正電荷；氨基修飾后，接觸角由51.5

5、°減小至33.4°，表明載體的親水性增強(qiáng)，疏水性減弱。
　?、?α-HSDH和7β-HSDH固定化工藝的建立。以氨基修飾密度為67.6μmol/g的氨基-環(huán)氧基樹(shù)脂固定化7α-HSDH和7β-HSDH，酶活可達(dá)到最高值。在相同的固定化條件下，與環(huán)氧基樹(shù)脂固定化酶相比，用氨基-環(huán)氧基樹(shù)脂（修飾密度為67.6μmol/g）固定化7α-HSDH和7β-HSDH，酶活分別提高了5.8倍和1.25倍。不同載體固定得到的固定化酶固定率及酶活的

6、差異，主要是由于兩種載體的固定化原理不同所致。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化確定了氨基-環(huán)氧基樹(shù)脂固定化酶的條件：7α-HSDH和7β-HSDH的最佳固定化時(shí)間分別為4h和3h；最佳固定化溫度均為15℃；最佳固定化pH均為7.5。在此固定化條件下，可得到酶活較高的固定化酶。
　?、酃潭ɑ傅拿笇W(xué)性質(zhì)的研究。固定化7α-HSDH和7β-HSDH的最適反應(yīng)溫度分別為20℃和25℃；固定化7α-HSDH和7β-HSDH的最適pH分別為10和5.

7、5。對(duì)比固定前后米氏常數(shù)Km值的變化，發(fā)現(xiàn)固定后7α-HSDH對(duì)TCDCA和NADP+的親和力減小；而7β-HSDH對(duì)T-7-KLCA的親和力增加，對(duì)NADPH的親和力減小。通過(guò)與游離酶的比較發(fā)現(xiàn)，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提高。當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，游離7α-HSDH和7β-HSDH的保留酶活分別還剩50.67%和58%，而固定化酶在此溫度下的保留酶活分別約為73.52%和84.08%。固定化7α-HSDH和7β-HSDH連續(xù)催化轉(zhuǎn)化6次，

8、其剩余酶活分別為79.4%和83.1%，具有較好的操作穩(wěn)定性；將固定化7α-HSDH和7β-HSDH在pH8.0、4℃條件下貯藏4周后，剩余酶活分別為49.1%和66.4%，具有較好的貯藏穩(wěn)定性。
　?、?α-HSDH和7β-HSDH的雙酶共固定研究。采用先固定7β-HSDH，再固定7α-HSDH的方式，在25℃，pH8.0的催化條件下，TUDCA的產(chǎn)率可達(dá)到31.57%；當(dāng)7α-HSDH與7β-HSDH兩酶的比例為3:1，可獲得