高通量結(jié)構(gòu)光層析雙色熒光小鼠全腦成像方法研究.pdf

1、大腦是我們身體中最為神秘的器官，也是我們思想、認(rèn)知、情感、記憶的來(lái)源。大腦中包含數(shù)量極為龐大的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元互相連接構(gòu)成了極為復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是腦功能實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)，而我們卻對(duì)它知之甚少。要理解大腦的工作機(jī)制，我們需要獲得完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。高通量的光學(xué)成像方法在對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成像方面起到了至關(guān)重要的作用。但是已有的光學(xué)全腦成像技術(shù)存在諸多限制，高分辨的成像方法通量較低，而且沒(méi)有為神經(jīng)元定位提供細(xì)胞構(gòu)筑背景。為此，本文提出了一套

2、基于結(jié)構(gòu)光切片技術(shù)的高通量雙色小鼠全腦成像方法，目的在于建立能夠快速、高分辨地同時(shí)獲取神經(jīng)元三維形態(tài)結(jié)構(gòu)以及共定位細(xì)胞構(gòu)筑背景的全腦成像技術(shù)方案。
　　首先本文提出了高通量全腦光學(xué)成像與定位單神經(jīng)元的實(shí)現(xiàn)方案。利用寬場(chǎng)并行探測(cè)的特點(diǎn)提高數(shù)據(jù)采集通量，使用樣本塊表面成像的方式實(shí)現(xiàn)全腦光學(xué)成像，通過(guò)分離成像和切削過(guò)程，提升了全腦成像的穩(wěn)定性，也有利于成像速度的進(jìn)一步提升。同時(shí)，為了解決厚組織塊寬場(chǎng)成像的背景熒光干擾，提出使用光吸收劑來(lái)

3、抑制樣本塊底層的熒光信號(hào)，降低了厚組織背景熒光對(duì)寬場(chǎng)成像質(zhì)量的影響。采用結(jié)構(gòu)光層析方法，實(shí)現(xiàn)了高分辨率的三維成像。為了實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的準(zhǔn)確定位，在成像中提供共定位的細(xì)胞構(gòu)筑背景，對(duì)常用核酸染料在樹(shù)脂包埋腦組織上的細(xì)胞復(fù)染性能進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)展了在樣本塊表面成像過(guò)程中對(duì)樣本塊表面進(jìn)行實(shí)時(shí)細(xì)胞胞體復(fù)染的方法。
　　為了充分發(fā)揮結(jié)構(gòu)光成像技術(shù)并行探測(cè)的高通量?jī)?yōu)勢(shì)，研究了在不影響成像分辨率的前提下，提升結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡成像速度的方案。從結(jié)構(gòu)光實(shí)

4、現(xiàn)光學(xué)切片的原理出發(fā)，分析了影響成像分辨率、信噪比的因素，指出傳統(tǒng)實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)照明的灰度調(diào)制方法是限制結(jié)構(gòu)光成像速度的關(guān)鍵性因素。從提高光場(chǎng)的調(diào)制速度和調(diào)制效率出發(fā)，提出使用二值調(diào)制的方式產(chǎn)生結(jié)構(gòu)照明圖案。結(jié)合數(shù)字微鏡陣列與科學(xué)級(jí)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體探測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了快速的結(jié)構(gòu)光層析成像，大幅提升了結(jié)構(gòu)光顯微成像的速度，使得成像通量較現(xiàn)有技術(shù)提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　最后，本文研制了一套結(jié)構(gòu)光照明熒光光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)（structure

5、d illumination fluorescence micro optical sectioning tomography, SI-fMOST），整合了快速結(jié)構(gòu)光顯微成像以及薄切片子系統(tǒng)。提出一種并行的結(jié)構(gòu)光成像數(shù)據(jù)重建及壓縮方法，實(shí)現(xiàn)高通量雙通道數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)重建及存儲(chǔ)。設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)的采集控制軟件，能夠進(jìn)行全腦數(shù)據(jù)自動(dòng)采集。對(duì)雙色成像系統(tǒng)的關(guān)鍵部件進(jìn)行了校準(zhǔn)，測(cè)量了成像的關(guān)鍵參數(shù)，保證了成像數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及自配準(zhǔn)的特性。基于蘇丹黑B

6、-GMA（Glycol Methacrylate）樹(shù)脂包埋的Thy1-eGFP-M轉(zhuǎn)基因小鼠鼠腦，使用SI-fMOST獲取了一套單神經(jīng)元分辨的雙色全腦數(shù)據(jù)集，首次得到了來(lái)自同一只小鼠全腦的包括神經(jīng)元精細(xì)形態(tài)與共定位細(xì)胞構(gòu)筑背景的完整高分辨率全腦數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集總共耗時(shí)77小時(shí)，充分證明了SI-fMOST系統(tǒng)高通量的特性。利用該數(shù)據(jù)集，展示了鼠腦桶狀皮層處單個(gè)功能柱內(nèi)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的三維重建結(jié)果，證明了SI-fMOST系統(tǒng)在神經(jīng)生物學(xué)研究中的