八角內(nèi)生真菌的分離及其生物轉(zhuǎn)化苯類香料的研究.pdf

1、八角是廣西的特色香料植物，其被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。本文從八角果、葉、枝等部位分離純化八角內(nèi)生真菌，對反式茴腦、肉桂醛以及苯乙酮等苯類香料進行了生物轉(zhuǎn)化研究，主要研究內(nèi)容和成果如下:
　　1.八角內(nèi)生真菌的分離、反式茴腦轉(zhuǎn)化活性菌株的篩選和鑒定
　　采用組織貼片平板培養(yǎng)的方法，從八角果、枝、葉中各分離獲得24、32和23共79株內(nèi)生真菌。利用微生物細胞生物轉(zhuǎn)化方法，經(jīng)底物耐受試驗、TLC分析和HPLC分析，從79株內(nèi)生

2、真菌中篩選得到BGEF13和BJEF32，兩菌株轉(zhuǎn)化反式茴腦得到的產(chǎn)物分別為茴香醇和異香蘭酸，形態(tài)學和分子生物學鑒定結(jié)果表明，BGEF13歸屬為稻黑孢菌Nigrospora oryzae，BJEF32為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia pseudotheobromae。
　　2.八角內(nèi)生真菌L.pseudotheobromae BJEF32轉(zhuǎn)化反式茴腦合成異香蘭酸
　　采用單因素試驗方法考察了轉(zhuǎn)化條件和細胞培養(yǎng)條件對

3、八角內(nèi)生真菌L.pseudotheobromae BJEF32轉(zhuǎn)化反式茴腦合成異香蘭酸的影響。適宜的轉(zhuǎn)化條件為:以0.05mol·L-1pH7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液為反應介質(zhì)，在100mL三角瓶中，裝液量為20mL，菌體細胞濃度為50g·L-1，底物反式茴腦濃度為1.48g·L-1，輔助底物葡萄糖濃度為10g·L-1，置于搖床中150rpm、30℃轉(zhuǎn)化48h;適宜的細胞培養(yǎng)條件為:液體培養(yǎng)基中馬鈴薯濃度為250g·L

4、-1、葡萄糖濃度為20g·L-1、反式茴腦濃度為0.1g·L-1，初始pH7.0，裝液量為100mL/250mL三角瓶，接種量為ψ6mm菌餅10個，接種后于28℃、150rpm搖床培養(yǎng)96h。在上述條件下，異香蘭酸的產(chǎn)率為62％，轉(zhuǎn)化液中異香蘭酸的濃度達1.03g·L-1。酶學實驗和中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果表明，八角內(nèi)生真菌L.pseudotheobromae BJEF32轉(zhuǎn)化反式茴腦合成異香蘭酸的可能途徑為:反式茴腦→反式茴腦環(huán)氧化物→反

5、式茴腦二醇→茴香醛/茴香醇→茴香酸→異香蘭酸。
　　3.八角內(nèi)生真菌N.oryzae BGEF13轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醇
　　采用單因素試驗方法優(yōu)化八角內(nèi)生真菌N.oryzae BGEF13轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醇的條件，得到轉(zhuǎn)化條件為:以0.05mol·L-1pH6.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液為反應介質(zhì)，在100mL三角瓶中，裝液量為40mL，菌體細胞濃度為50g·L-1，底物反式茴腦濃度為2.96g·L-1，

6、輔助底物葡萄糖濃度為10g·L-1，置于搖床中120rpm、30℃轉(zhuǎn)化24h;適宜的細胞培養(yǎng)條件為:液體培養(yǎng)基中馬鈴薯濃度為200g·L-1、葡萄糖濃度為20g·L-1、蛋白胨濃度為2g·L-1、反式茴腦濃度為0.1g·L-1，初始pH6.5，裝液量為100mL/250mL三角瓶，接種量為ψ6mm菌餅10個，接種后于28℃、120rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)96h。在優(yōu)化條件下，茴香醇的產(chǎn)率達42％左右，轉(zhuǎn)化液中茴香醇的濃度達1.16g·L-1

7、。酶學實驗和中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果表明，八角內(nèi)生真菌N.oryzae BGEF13轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醇的可能途徑為:反式茴腦→反式茴腦環(huán)氧化物→反式茴腦二醇→茴香醛→茴香醇/茴香酸。
　　4.八角內(nèi)生真菌催化苯乙酮還原合成手性化合物R-(+)-1-苯乙醇
　　從八角內(nèi)生真菌中篩選獲得一株新殼梭孢菌Neofusicoccum parvum BYEF07，它能催化苯乙酮高選擇性還原合成手性化合物1-苯乙醇，產(chǎn)物以R-(+)-1-

8、苯乙醇為主。轉(zhuǎn)化適宜條件為:以0.05g·L-1pH7.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液為反應介質(zhì)，在100mL三角瓶中，裝液量為40mL,底物苯乙酮的濃度為1.8g·L-1、菌體濃度為100g·L-1、輔助底物葡萄糖濃度為10g·L-1、裝液量為40mL/100mL三角瓶、搖床轉(zhuǎn)速150rpm、反應溫度為30℃、反應時間為48h;細胞培養(yǎng)的適宜條件為:液體培養(yǎng)基中馬鈴薯濃度為250g·L-1、蔗糖濃度為20g·L-1、初始pH

9、7.5、裝液量為100mL/250mL三角瓶、接種量為ψ6mm菌餅12個，接種后于28℃、120rpm搖床培養(yǎng)120h。在上述條件下，1-苯乙醇的摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達85％，轉(zhuǎn)化液中1-苯乙醇的濃度達1.55g·L-1，R-(+)構(gòu)型的ee值可達99％。
　　八角內(nèi)生真菌N.parvum BYEF07細胞催化苯乙酮不對稱還原生成1-苯乙醇的過程中存在底物抑制和產(chǎn)物抑制效應。采用Han-Levenspiel模型擬合得底物抑制反應模型中的各

10、參數(shù)為:Vsm=0.082mmol·L-1·g-1·h-1，Ks=4.24mmol·L-1，Sc=95mmol·L-1，n=1.45;產(chǎn)物抑制反應模型中的各參數(shù)為:Vpm=0.051mmol·L-1·g-1·h-1,Pc=146mmol·L-1,m=1.28。
　　5.八角內(nèi)生真菌催化肉桂醛加氫合成肉桂醇和3-苯丙醇
　　從八角內(nèi)生真菌中篩選得到塔賓曲霉Aspergillus tubingensis BGEF03和葡萄座腔菌

11、Botryosphaeria dothidea BGEF10，它們能選擇性催化肉桂醛加氫生成肉桂醇和3-苯丙醇。
　　Aspergillus tubingensis BGEF03轉(zhuǎn)化肉桂醛合成肉桂醇的適宜反應條件為:以0.05mol·L-1pH6.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液作為反應介質(zhì)，在100mL三角瓶中的裝液量為40mL，底物濃度為1.5g·L-1，菌體細胞濃度為50g·L-1，輔助底物葡萄糖濃度為10g·L-1

12、，搖床轉(zhuǎn)速120rpm、25℃下轉(zhuǎn)化24h。在此條件下，肉桂醇的產(chǎn)率達58.5％，轉(zhuǎn)化液中肉桂醇的濃度可達0.89g·L-1，體系中未檢測到3-苯丙醇。
　　Botryosphaeria dothidea BGEF10催化肉桂醇加氫合成3-苯丙醇的適宜條件為:以0.05mol·L-1pH7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液為反應介質(zhì)，在100mL三角瓶中裝液量為40mL，菌體細胞濃度為75g·L-1，底物濃度為1.0g·L