ε-聚賴氨酸菌種選育及合成途徑的初步研究.pdf

1、近年來，食品安全問題得到政府和社會(huì)的高度關(guān)注，毋庸諱言，食品防腐劑也是食品安全關(guān)鍵因素之一。ε-聚賴氨酸(ε-polylysine，ε-PL)是一種L-賴氨酸同聚物，具有抑菌譜廣、水溶性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性、可生物降解、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，是食品防腐劑的理想選擇;ε-聚賴氨酸可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得，但ε-聚賴氨酸產(chǎn)量低是限制其工業(yè)化生產(chǎn)的主要因素，因此提高微生物發(fā)酵產(chǎn)ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量具有十分重要的意義。本研究旨在通過菌種選育，優(yōu)化發(fā)酵條件，研究

2、ε-聚賴氨酸合成途徑中間代謝產(chǎn)物對(duì)合成ε-聚賴氨酸的影響，以期提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量;并通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)初步探究鏈霉菌ε-PL產(chǎn)量提高的分子水平原因及其合成途徑。
　　以菌株SAB為出發(fā)菌株，通過對(duì)該菌株的形態(tài)觀察，生理生化實(shí)驗(yàn)分析以及16SrRNA分子生物學(xué)鑒定，初步鑒定菌株SAB為Streptomyces albulus（白色鏈霉菌）。并對(duì)菌株SAB進(jìn)行常壓室溫等離子體(ARTP)誘變育種，結(jié)合核糖體工程育種，利用鏈霉素抗性平

3、板，甘氨酸和ε-PL抗性平板篩選突變菌株，最終從349株突變菌株中篩得遺傳性能穩(wěn)定的ε-PL高產(chǎn)菌株SAY6，ε-PL產(chǎn)量可達(dá)2.096g/L，與原始菌株SAB(0.959g/L)相比，提高118.6％。
　　通過正交試驗(yàn)確定菌株SAY6的最適培養(yǎng)基:葡萄糖5.0％，酵母粉0.50％，硫酸銨1.0％;單因素實(shí)驗(yàn)確定最適發(fā)酵條件:種齡20h，接種量10％，培養(yǎng)基裝量80mL/500mL，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間72h，發(fā)酵

4、至24h調(diào)節(jié)pH至4.5。經(jīng)過培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后ε-PL產(chǎn)量為2.536g/L，與優(yōu)化前2.096g/L相比，產(chǎn)量提高20.1％。通過研究ε-PL合成途徑中間代謝產(chǎn)物檸檬酸、L-天冬氨酸和L-賴氨酸對(duì)ε-PL合成的影響，確定在發(fā)酵開始添加終濃度為1.00g/L的檸檬酸，發(fā)酵至12h添加終濃度為0.35g/L的L-天冬氨酸和1.00g/L的L-賴氨酸對(duì)促進(jìn)ε-PL合成效果最明顯，ε-PL產(chǎn)量可達(dá)3.334g/L，進(jìn)一步提高31.5％;

5、較出發(fā)菌株SAB提高247.7％。
　　通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析出發(fā)菌株SAB與ε-PL高產(chǎn)菌株SAY6的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜，與出發(fā)菌株相比，高產(chǎn)菌株SAY6有773個(gè)基因表現(xiàn)上調(diào)，714個(gè)基因表現(xiàn)下調(diào);通過對(duì)影響ε-PL合成途徑分析，發(fā)現(xiàn)ε-PL的合成可能以檸檬酸-谷氨酸-賴氨酸途徑為主要通路，過量的產(chǎn)物抑制天冬氨酸-賴氨酸途徑，而在賴氨酸降解途徑中差異表達(dá)基因較多表現(xiàn)為下調(diào)，抑制賴氨酸的降解，為ε-PL合成積累更多底物，初步揭示