生化分離工程復(fù)習(xí)提綱

1、第一章 第一章 生化分離的研究歷史 生化分離的研究歷史1.生化分離工程 生化分離工程：通過微生物發(fā)酵過程、酶反應(yīng)過程或動植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得生物化工產(chǎn)品，從上述發(fā)酵液、反應(yīng)液或培養(yǎng)液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過程即稱為生化分離工程或稱下游加工過程。2.上游 上游：菌種，基因工程，分子生物學(xué)，遺傳學(xué)3.中游 中游：微生物發(fā)酵工程，動植物細(xì)胞培養(yǎng)， 海洋生物培養(yǎng)4.下游 下游：生物分離工程第二章 第二章 發(fā)酵液預(yù)處理 發(fā)酵液預(yù)處理1.生物分離過

2、程的一般流程 生物分離過程的一般流程2.生物分離工藝要求 生物分離工藝要求：（1）高純度；（2）大規(guī)模；（3）經(jīng)濟(jì)性；（4）生物相容性。3.對產(chǎn)物的要求 對產(chǎn)物的要求：（1）保持生物產(chǎn)物的活性；純度要求高；（2）當(dāng)生物技術(shù)產(chǎn)品是食品或藥物時，要求無污染物、無對映體、無病毒、無熱原無致敏原；（3）從發(fā)酵液和細(xì)胞培養(yǎng)液中提取所需生化物質(zhì)的第一步，分兩部分：預(yù)處理 預(yù)處理和固液分離。 固液分離。4.發(fā)酵液的成分 發(fā)酵液的成分：包含菌（細(xì)胞）體

3、，胞內(nèi)產(chǎn)物，胞外產(chǎn)物及剩余的培養(yǎng)基殘分等。對于胞外產(chǎn)物，可先將菌體或其他懸浮雜質(zhì)去除，才能從澄清的濾液中提取代謝產(chǎn)物。對于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先富集菌體，再進(jìn)行細(xì)胞破碎和碎片分離，然后提取胞內(nèi)產(chǎn)物。5.發(fā)酵液預(yù)處理的原因： 發(fā)酵液預(yù)處理的原因： （1）液相粘度大，大多為非牛頓型流體，不易過濾，所需物質(zhì)多在液相；（2）發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為 1-10%；（3）發(fā)酵液成分復(fù)雜，不利于提取產(chǎn)物。5.預(yù)處理的目的 預(yù)處理的目的：促進(jìn)從懸浮液中分離固形

4、物的速度，提高固液分離的效率（1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，包括增大懸浮液中固體粒子的尺寸，降低液體黏度；（2）相對純化，去除發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)（高價無機離子和雜蛋白質(zhì)），以利于后續(xù)各步操作。（3）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移進(jìn)入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）。6.發(fā)酵液雜質(zhì)的去除： 發(fā)酵液雜質(zhì)的去除：（不同雜質(zhì)的去除方法：發(fā)酵液成分復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物與各種雜質(zhì)溶解在一起。這些雜質(zhì)中對提取影響最大的是高價無機離子和雜蛋白。）（1）無機離子的去除 無機離子

5、的去除：鈣離子，在發(fā)酵液中加入草酸，可出去鈣離子。鎂離子，由于發(fā)酵液中鎂離子含量通常不高，利用草酸很難完全出去鎂離子。此時，可加入三聚磷酸鈉，三聚磷酸鈉與鎂離子形成可溶性絡(luò)合物，即可除去鎂離子。鐵離子，發(fā)酵液中的鐵離子，一般用黃血巖去除，使其形成普魯士藍(lán)沉淀。（2）可溶性蛋白質(zhì)的去除： 可溶性蛋白質(zhì)的去除：①鹽析法；②等點沉淀法；③有機溶劑沉淀法；④其他沉淀法；⑤加熱法；⑥吸附法A.鹽析法 鹽析法：常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸

6、鈉、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用最多的硫酸銨。影響鹽析的因素有：a.溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4℃）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶解度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25℃）比 0℃時溶解度低，更容易鹽析；b.pH 值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶解度最低；c.蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量

7、生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在 2.5-3.0%。B.沉淀法 沉淀法：原料液細(xì)胞分離 ( 離心，過濾 )細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一 路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一 A 路線一 B清液－胞外產(chǎn)物粗分離 ( 鹽析、萃取、超過濾等 )純化( 層析、電泳 )脫鹽( 凝膠過濾、超過濾 )濃縮( 超過濾 )精制( 結(jié)晶、干燥 )包含體溶解( 加鹽酸胍、脲 )復(fù)性原料液細(xì)胞分離 ( 離心，過濾 )細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物 路線一 路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一 A 路線一

8、 B清液－胞外產(chǎn)物粗分離 (鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性（4）對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，改善濾液性質(zhì)。6.錯流過濾 錯流過濾（切向流過濾）：傳統(tǒng)過濾時過濾液體垂直于過濾介質(zhì)，過濾阻力主要來自濾餅。錯流過濾打破了傳統(tǒng)過濾的機制，即液體的流向和濾膜相切。在壓力推動下，懸浮液以高速在管狀濾膜的內(nèi)壁作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅

9、）移走，而附著在濾膜上的濾餅很薄，因而能在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定不變的過濾速度。7.離心分離 離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。優(yōu)點：分離速度快；分離效率高；液相澄清度好。8.離心機的種類與用途 離心機的種類與用途常速離心機：8000r/min，用于細(xì)胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；高速（冷凍）離心機：1-2.5×104r/min，用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離

10、；超速離心機：轉(zhuǎn)速 2.5-8×104r/min，用于 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、病毒分離純化；檢測純度、沉降系數(shù)和相對分子量測定等。第四章 第四章 細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù) 細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)1.不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型 不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型：對于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎 對于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎動物細(xì)胞：多分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液；植物細(xì)胞：多為胞內(nèi)產(chǎn)物；微生物：（細(xì)菌/酵母/

11、真菌）胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物。2.細(xì)胞破碎 細(xì)胞破碎：技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。3.細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。4.細(xì)胞破碎技術(shù) 細(xì)胞破碎技術(shù)：A.機械破碎法 機械破碎法：高壓勻漿破碎法，高速珠研磨破碎法，超聲波破碎法。機械破碎：通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎（搗碎法、研磨法、勻漿法、超聲法）。高壓勻漿法適用的范圍

12、：酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，20%左右。 不宜使用高壓勻漿法：易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌；較小的革蘭氏陽性菌；含有包涵體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）。B.非機械破碎法 非機械破碎法：物理破碎：通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎（溫度差破碎法、壓力差破碎法、滲透壓沖擊法、凍結(jié)和融化法、干燥法）?；瘜W(xué)破碎：通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎（有機溶劑、表面活性劑、

13、酸堿、EDTA 螯合劑）。酶促破碎：通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎（自溶法、外加酶制劑法）。第五章 第五章 生物產(chǎn)品萃取技術(shù) 生物產(chǎn)品萃取技術(shù)1.萃取 萃取：溶質(zhì)從料液轉(zhuǎn)移到萃取劑的過程。當(dāng)含有生化物質(zhì)的溶液與互不相溶的第二相接觸時，生化物質(zhì)傾向于在兩相之間進(jìn)行分配，當(dāng)條件選擇得恰當(dāng)時，所需提取的生化物質(zhì)就會有選擇性地發(fā)生轉(zhuǎn)移，集中到一相中，而原來溶液中所混有的其它雜質(zhì)（如中間代謝產(chǎn)物、

14、雜蛋白等）分配在另一相中，這樣就能達(dá)到某種程度的提純和濃縮。 2.反萃取 反萃?。喝苜|(zhì)從萃取劑轉(zhuǎn)移到反萃劑的過程。在完成萃取操作后，為進(jìn)一步純化目標(biāo)產(chǎn)物或便于下一步分離操作的實施，將目標(biāo)產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的操作就稱為反萃取。3.雙水相現(xiàn)象 雙水相現(xiàn)象：是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時，由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性，當(dāng)聚合物或無機鹽濃度達(dá)到一定值時，就會分成不互溶的兩相。因使用的溶劑是水，因此稱為雙水相。常用

15、的雙水相體系 常用的雙水相體系：PEG/葡聚糖體系和 PEG/磷酸鹽體系。PEG/葡聚糖體系一般用于小規(guī)模地分離生物大分子、膜、細(xì)胞等；PEG/無機鹽體系主要用來大規(guī)模地提純酶，這是因為 PEG/無機鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價格昂貴的緣故。雙水相萃取的基本特點： 雙水相萃取的基本特點：①體系有生物親和性；②非常適合大規(guī)模應(yīng)用；③操作容易進(jìn)行控制；④可與細(xì)胞破碎相結(jié)合；⑤能進(jìn)行萃取性的生物轉(zhuǎn)化；⑥可進(jìn)行親和萃取。雙水相萃取的優(yōu)點：