四川黑茶渥堆過(guò)程中纖維素酶、果膠酶分泌菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、四川黑茶具有獨(dú)特的地域性和政治特征，其品質(zhì)高低直接影響邊疆少數(shù)民族同胞的身體健康、邊疆穩(wěn)定和民族團(tuán)結(jié)。渥堆作為四川黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序，其濕熱環(huán)境有利于微生物的生長(zhǎng)、繁殖，渥堆微生物所分泌的纖維素酶、果膠酶等水解酶類(lèi)對(duì)四川黑茶品質(zhì)的轉(zhuǎn)化及形成功不可沒(méi)。研究者對(duì)黑茶渥堆過(guò)程的微生物進(jìn)行了大量研究，但對(duì)四川黑茶渥堆微生物所分泌的纖維素酶、果膠酶及其相關(guān)性質(zhì)的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，明確四川黑茶渥堆微生物中分泌纖維素酶、果膠酶的主要微生物種類(lèi)

2、，研究其纖維素酶特性，深入分析其在四川黑茶品質(zhì)形成中的具體作用，對(duì)于擴(kuò)大食品等行業(yè)纖維素酶、果膠酶微生物來(lái)源及其進(jìn)一步應(yīng)用，縮短四川黑茶生產(chǎn)周期，提高其品質(zhì)具有重要意義。此外，進(jìn)一步探索和優(yōu)化微生物纖維素酶產(chǎn)酶條件，對(duì)于提高微生物纖維素酶活性具有重要的實(shí)踐意義。
　　本研究擬采用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)手段，微生物平板技術(shù)及常用手段相結(jié)合的方式，篩選四川黑茶渥堆微生物中纖維素酶、果膠酶分泌菌株，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行研究，對(duì)纖維素酶分泌

3、菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行探索和優(yōu)化。此外，采用液態(tài)發(fā)酵的方式分析纖維素酶、果膠酶分泌菌株對(duì)液態(tài)茶品質(zhì)成分的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)從四川黑茶渥堆微生物中共篩得分解纖維素效果較好的菌株18株，其中，酵母菌1株，霉菌6株，放線菌7株，細(xì)菌4株，其分解纖維素能力大小依次為:放線菌＞細(xì)菌＞酵母菌＞霉菌。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，放線菌分泌纖維素酶活性整體高于細(xì)菌和真菌，綜合初篩、復(fù)篩結(jié)果，選擇SDT18、SDT53、SDT95號(hào)菌株為分

4、泌纖維素酶的高產(chǎn)菌株。分子生物學(xué)分析結(jié)果分別將SDT18、SDT95、SDT53號(hào)菌株初步鑒定為Aspergillus niger strain FCBP648（黑曲霉）、Bacillusubtilis strain ZZ120(枯草芽孢桿菌）、Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacusstrain HDJZ-zwm-45（淀粉酶鏈霉菌亞種）。搖瓶培養(yǎng)期間，SDT95號(hào)菌株其菌株生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的

5、延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，而其CMCase和FPA酶活性并未出現(xiàn)大幅度的變化;使SDT95號(hào)菌株的CMCase酶活達(dá)到最大時(shí)的酶反應(yīng)pH為5，使其CMCase酶活較高的酶反應(yīng)溫度依次為45℃＞55℃＞40℃＞50℃。
　　(2)在液體培養(yǎng)基組分及濃度優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組分及濃度進(jìn)行優(yōu)化，得出利于纖維素酶分泌菌株SDT95產(chǎn)CMCase的液體培養(yǎng)基組分配比為:葡萄糖1.68％，牛肉膏0.82％

6、，氯化鈉0.32％，磷酸氫二鉀0.22％，利于菌株產(chǎn)FPA的液體培養(yǎng)基組分配比為:葡萄糖1.63％，牛肉膏0.86％，氯化鈉0.37％，磷酸氫二鉀0.16％。在搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)搖床培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出利于SDT95菌株CMCase酶活提高的搖床培養(yǎng)條件為:菌株接種量2ml，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間6d，搖床培養(yǎng)溫度29℃。實(shí)驗(yàn)所考察的3個(gè)因素對(duì)FPA酶活的影響均較小，F(xiàn)PA酶活可能還受到其它未被考

7、慮進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案的因素所影響。
　　(3)從四川黑茶渥堆微生物中初篩得到分泌果膠酶效果較明顯的菌株共19株，其中，酵母菌1株，霉菌6株，放線菌9株，細(xì)菌3株。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)測(cè)得各類(lèi)群微生物分泌果膠酶活性依次為放線菌＞細(xì)菌＞霉菌＞酵母菌。結(jié)合初篩、復(fù)篩結(jié)果選得SDT22、SDT60、SDT87號(hào)菌株為分泌果膠酶的高產(chǎn)菌株。分子生物學(xué)分析結(jié)果分別將SDT22、SDT87、SDT60號(hào)菌株初步鑒定為Penicilliumcommune s

8、train G20-23（普通青霉）、Streptomyces thermoviolaceus（熱紫鏈霉菌）、Streptomyces pactum strain173612（密旋鏈霉菌）。
　　(4)篩得的分泌纖維素酶、果膠酶效果較好的菌株在以純茶湯為培養(yǎng)基的單菌液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中均能造成茶湯中茶多酚含量的降低;除SDT93號(hào)菌株外，均能造成茶湯中茶黃素含量的增加;供試菌株對(duì)茶湯茶紅素、茶褐素含量的影響相對(duì)比較復(fù)雜;除SDT4、87