棉花液泡h39;atpasec亞基基因ghdet3的克隆與功能分析

1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文棉花液泡H-ATPase C亞基基因GhDET3的克隆與功能分析姓名：肖忠意申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：羅明20080501摘要( A b s t r a c t )中文捅要棉花是世界上一種重要的纖維作物。棉花纖維是棉花胚珠表面突起分化出的單個(gè)細(xì)胞，能夠快速伸長(zhǎng)并且進(jìn)行次生壁的合成。棉花纖維的發(fā)育過程分為四個(gè)階段，包括纖維細(xì)胞起始、纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)、次生壁合成和脫水成熟。其中在纖維快速伸長(zhǎng)時(shí)期纖

2、維細(xì)胞的每天伸長(zhǎng)速度最快可以達(dá)到2 ．O m m o 纖維的長(zhǎng)度是纖維品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)也是一個(gè)對(duì)纖維產(chǎn)量具有重要權(quán)重的農(nóng)藝性狀。因此，纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)對(duì)成熟纖維的最終長(zhǎng)度具有決定作用。傳統(tǒng)育種方法曾經(jīng)為棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的提高做出了巨大貢獻(xiàn)，但利用傳統(tǒng)育種方法難以打破纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的負(fù)相關(guān)，難以達(dá)到產(chǎn)量和品質(zhì)的同步提高?；蚬こ炭梢詫?shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的定向改良，但需要了解纖維發(fā)育的分子機(jī)理和獲得相關(guān)的目標(biāo)基因以及適宜的啟動(dòng)子。由于棉花分子生

3、物學(xué)的研究的時(shí)間尚短，所以目前對(duì)棉花纖維伸長(zhǎng)的主要機(jī)制還不清楚。因此，克隆和了解棉花纖維細(xì)胞起始和伸長(zhǎng)相關(guān)的關(guān)鍵基因，探索纖維伸長(zhǎng)的分子機(jī)制，將為利用基因工程改良棉花纖維提供理論基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)基因材料。植物激素是指在植物體內(nèi)合成的、對(duì)植物生長(zhǎng)具有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物質(zhì)。油菜素類固醇類物質(zhì)是第六大植物激素。外施油菜素內(nèi)酯能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，達(dá)到增產(chǎn)增質(zhì)效果。雖然前人發(fā)現(xiàn)棉花纖維細(xì)胞中B R s 合成酶基因在纖維起始和伸長(zhǎng)過程中具有重要作用，在棉

4、花纖維中超量表達(dá)B 黜合成酶基因能夠改良纖維數(shù)量和質(zhì)量，但是目前尚未見通過轉(zhuǎn)基因棉花手段了解B 風(fēng)信號(hào)途徑基因?qū)γ藁ɡw維細(xì)胞起始和伸長(zhǎng)的影響的報(bào)道。因此，從B 飚信號(hào)途徑基因探索棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的意義，對(duì)培育新的棉花品種具有重大的潛力。液泡曠仰勰e 具有夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓的功能，并且由于其在纖維伸長(zhǎng)時(shí)期的酶活性最高，因此前人認(rèn)為V 二A r P 弱e 能夠調(diào)節(jié)對(duì)棉花纖維的生長(zhǎng)和發(fā)育。D E 乃基因編碼V 二A 皿弱eC 亞

5、基基因，對(duì)V - A T P 勰e 的酶活性具有重要的調(diào)節(jié)作用，D E 刀基因的缺失突變體表現(xiàn)為B 心缺失的典型性狀，卻對(duì)外施B R s 不敏感，因而認(rèn)為D E T 3 介導(dǎo)了B 飚信號(hào)途徑的快速反應(yīng)途徑，從而促進(jìn)的細(xì)胞伸長(zhǎng)。為了了解v ．A T P a ∞C 亞基基因棉花纖維發(fā)育的影響，本實(shí)驗(yàn)克隆了棉花液泡礦．A T P a S eC 亞基基因( 眺乃) ，并對(duì)基因序列和表達(dá)特征進(jìn)行了分析，然后利用轉(zhuǎn)基因煙草和棉花分析了G 矗腳乃基因

6、的功能。主要結(jié)果如下：一、鋤D E 乃基因克隆和表達(dá)分析通過A t D E T 3 探針在N C B I 數(shù)據(jù)庫中篩選和整合相關(guān)E s T 序列，并利用3 ’．R A C E 克隆了G 加E 乃基因的3 ’一端序列，并最終獲得了G —杞匠乃的c D N A 和g D N A 序列。該基因氨基酸序列與其它物種的同源分析結(jié)果表明G l l D E T 3 與擬南芥、水稻、苜蓿、大麥和玉米等物種的v ．A T P 舔e C 亞基有較高的同源性

7、。G h D E T 3 的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有v ．A 皿夠e C 亞基保守結(jié)構(gòu)域，且其三級(jí)結(jié)構(gòu)與酵母同源蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似。Q u 鋤t i t a t i v er e a l ．t i m e P C R 分析各個(gè)組織和器官中G 庇腳乃基因的表達(dá)特征，結(jié)果表明G 址) E 乃基因在所有受測(cè)組織和器官中均有表達(dá)，但是在不同組織和器官中表達(dá)存在明顯差異。在基本組織中，G 址) E 乃基因在下胚軸中的表達(dá)水平較高，而在子葉和成熟葉片中的