pod_測(cè)定方法

1、植物體 POD 的測(cè)定※了解過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的幾種方法，掌握用愈創(chuàng)木酚法分別測(cè)定過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶的活性。過(guò)氧化物酶廣泛頒布于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計(jì)測(cè)量生成物的含量。※1、實(shí)驗(yàn)儀器 722 型分光光度計(jì)、離心機(jī)、秒表、電子天平、研缽2、實(shí)驗(yàn)試劑 愈創(chuàng)木酚、30%過(guò)氧化氫、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸緩沖液(pH6.0)、反應(yīng)混合

2、液［100mmol/L 磷酸緩沖液(pH6.0)50mL，加入愈創(chuàng)木酚 28uL，加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入 30%過(guò)氧化氫 19uL，混合均勻保存于冰箱中］3、實(shí)驗(yàn)材料 任何植物材料※1、粗酶液的提取 稱(chēng)取植物(小麥葉片)材料 0.1g，加 20mmol/LKH2PO4 5mL，于研缽中研磨成勻漿，以 10000r/min 離心 10 分鐘，收集上清液保存在冷處，所得殘?jiān)儆?0mmol/LKH2PO45mL 溶液

3、提取一次，全并兩次上清液。2、酶活性的測(cè)定 取比色皿 2 只，于一只中加入反應(yīng)混合液 3mL，KH2PO41mL，作為校零對(duì)照，另一只中加入反應(yīng)混合液 3mL，上述酶液 1mL(如酶活性過(guò)高可適當(dāng)稀釋)，立即開(kāi)啟秒表，于分光光度計(jì) 470nm 波長(zhǎng)下測(cè)量 OD 值，每隔 30s 讀數(shù)一次。以每分鐘表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg 蛋白質(zhì)表示，蛋白質(zhì)含量測(cè)定按 Folin 法進(jìn)行?！悦糠昼娢舛茸兓当硎久富钚源笮。匆?

4、ΔA470/[min.g(鮮重)]表示之。也可以用每 min內(nèi) A470 變化 0.01 為 1 個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位(u)表示。 過(guò)氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：ΔA470——反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化。 W——植物鮮重，g。 VT ——提取酶液總體積，mL。Vs ——測(cè)定時(shí)取用酶液體積 ,mL。 t——反應(yīng)時(shí)間，min。 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】植物體內(nèi)的黃素氧化酶類(lèi)代謝產(chǎn)物常包含 H202 ，如光呼吸中

5、的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202 的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用。過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)是清除 H202 的重要保護(hù)酶，能將 H202 分解為 02 和 H20,從而使機(jī)體免受H202 的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。(CAT)催化如下反應(yīng)：2 H202→2 H20+ 02本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定 H202 的減少量來(lái)測(cè)定 CAT 的活性。在 H202 存在條件下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生

6、成茶褐色的 4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)生成物的含量來(lái)測(cè)定活性?！驹噭┧幤?.50m mol/l pH7.0 的磷酸緩沖液2.0.3% H202: 吸 0.5ml 30% H202 加入 pH7.0 的磷酸緩沖液至 50ml3.0.2% 愈創(chuàng)木酚 :秤 0.2g 愈創(chuàng)木酚加入 pH7.0 的磷酸緩沖液至 100ml【實(shí)驗(yàn)步驟】酶液的制備1.稱(chēng)取葉片 0.25g ，加入 5 倍量的（M/V）pH7.0 的 PBS 冰浴研磨 1500

7、0r/min離心 15min 取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。2. CAT 活性的測(cè)定在 3ml 的反應(yīng)體系中，包括 0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入 0.05ml 酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng) 240nm 處的 OD 降低速度。將每分鐘 OD 減少 0.01 定義為 1 個(gè)活力單位。3. POD 活性的測(cè)定在 3ml 的反應(yīng)體系中，包括 0.3% H202 1ml, .0.2% 愈創(chuàng)木酚 0.95ml,