質(zhì)粒dna生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展

1、綜述：質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展一、質(zhì)粒DNA細(xì)菌質(zhì)粒（plas）是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成分，除了酵母的殺傷質(zhì)粒（killerplas）是一種RNA質(zhì)粒之外，迄今所知的所有質(zhì)粒無一例外地都是屬于這種類型的DNA分子[1]，質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代[2]，為了更好地適應(yīng)細(xì)胞的生理特點(diǎn)，質(zhì)粒主要以細(xì)長(zhǎng)并具有負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在于原核細(xì)

2、胞中[3]。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：超螺旋型（SC）質(zhì)粒DNA；開環(huán)型（OC）質(zhì)粒DNA和線性（L）質(zhì)粒DNA分子[4]。用于基因工程改造的質(zhì)粒載體通常包括復(fù)制子、選擇標(biāo)記和目的基因和啟動(dòng)子[5]，為了獲得高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA，在構(gòu)建質(zhì)粒DNA時(shí)，需仔細(xì)從以下幾個(gè)方面著手考慮。1.質(zhì)粒復(fù)制子的選擇Prazeres[6]報(bào)道到2010年，以質(zhì)粒為核心的基因免疫和治療的市場(chǎng)產(chǎn)值將會(huì)超過450億美元，質(zhì)粒DNA的需

3、求不斷加大。因此，無論從科學(xué)還是經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，在構(gòu)建DNA疫苗和基因治療用途的質(zhì)粒時(shí)，為了提高質(zhì)粒產(chǎn)量，復(fù)制子的選擇非常關(guān)鍵，目前，絕大多數(shù)學(xué)者選擇拷貝數(shù)高且僅需宿主編碼蛋白的ColE1復(fù)制子[7]。什么是導(dǎo)致此種復(fù)制子未得到開發(fā)的具體原因[19]。2.抗性基因的選擇在選擇抗生素抗性基因時(shí)，由于極少量即可引起部分人群強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)，首先應(yīng)避免β內(nèi)酰胺類抗生素的使用，而應(yīng)考慮氨基糖苷類的新霉素和卡那霉素[20]，因?yàn)檫@些氨基糖苷類的抗生素

4、在臨床上很少使用，且無耳毒性、腎毒性等副作用，所以更為合適[19]。3.其他元件的考慮設(shè)計(jì)、構(gòu)建DNA疫苗和基因治療質(zhì)粒載體的策略已經(jīng)十分明顯，它除了必須包括一個(gè)能使質(zhì)粒在大腸桿菌中維持、分裂的元件；一個(gè)能促使目的基因在機(jī)體內(nèi)表達(dá)的元件和選擇標(biāo)記外，還包括其他一些調(diào)控元件，以促使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和質(zhì)粒的穩(wěn)定[21]，這些元件包括真核啟動(dòng)子、終止子及其終止信號(hào)等，啟動(dòng)子是外源基因在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的必要前提，常見的有CMVIE、SV40、E

5、F1α及UbC和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更為有效，其中內(nèi)含子A更能提高CMVIE的表達(dá)水平[22]，CMV現(xiàn)已被廣泛使用在商品化載體上，這對(duì)商業(yè)開發(fā)DNA疫苗來說是十分有幫助的。另外，一些抗原基因本身來源的啟動(dòng)子也可用來構(gòu)建DNA疫苗，但對(duì)于想同時(shí)表達(dá)多個(gè)抗原基因的質(zhì)粒而言，此種啟動(dòng)子的效果不明顯；常用的轉(zhuǎn)錄終止子及終止信號(hào)包括牛生長(zhǎng)激素（BGH）、SV40及人β珠蛋白。此外，在構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可利用非甲