t-spottb不含醫(yī)院名稱

1、,結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測(cè)試劑盒（免疫斑點(diǎn)法）上海復(fù)星,,一、背景,,公司成立于2003年，依托牛津大學(xué)科研技術(shù)開發(fā)新產(chǎn)品基于T細(xì)胞檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)最先獲得認(rèn)可產(chǎn)品：T-SPOT®.TB 在歐洲、美國(guó)、加拿大和其它地區(qū)正式上市,Oxford Immunotec 公司簡(jiǎn)介,,Above: UK headquarters Abingdon, OxonBelow: US headquarters, Marlbor

2、ough, MA,結(jié)核病——全球關(guān)注的問(wèn)題全球20億人口感染結(jié)核新增活動(dòng)性結(jié)核病人約900萬(wàn)/年每年130萬(wàn)患者死亡中國(guó)450萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核病人新增活動(dòng)性結(jié)核病人約145萬(wàn)/年死亡人數(shù)約13萬(wàn)/年,試劑盒研制臨床背景,,活動(dòng)性結(jié)核與潛伏感染,,接觸活動(dòng)性結(jié)核病患者,,暴露程度不足，結(jié)核桿菌被機(jī)體免疫力清除,,,沒(méi)有癥狀,結(jié)核桿菌仍舊存在而不能被偵測(cè) X-光/ CT 掃描顯示正常沒(méi)有抗體應(yīng)答診斷困難傳統(tǒng)的結(jié)

3、核感染檢測(cè)只有 TST（PPD）,機(jī)體被感染,,受機(jī)體免疫力抑制沒(méi)有臨床癥狀,,終身處于感染狀態(tài),潛伏感染,,有臨床癥狀具有傳染性,結(jié)核桿菌可以通過(guò)涂片、培養(yǎng)檢測(cè)出胸部的 X-光或 CT 掃描顯示異常 肺外結(jié)核難以診斷 (特別是兒童),活動(dòng)性結(jié)核,,,5%,5%,再次激活,控制結(jié)核的關(guān)鍵,,早發(fā)現(xiàn)早治療,,二、方法原理,,γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn) （IGRAs，interferon- gamma release

4、assays ）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) （ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay）結(jié)核桿菌特異抗原 早期抗原靶6（ESAT-6，early secreted antigenic target 6 ） 培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10，culture filtrate protein 10 ）,試劑盒研制技術(shù)背景,,γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs）,,γ干擾素檢測(cè)陰

5、性,γ干擾素檢測(cè)陽(yáng)性,結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無(wú)論是否有臨床癥狀?；贗GRAs原理的產(chǎn)品目前已被美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、法國(guó)、荷蘭、日本等國(guó)家寫入本國(guó)的結(jié)核診療指南中,

6、γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs）,,1983年，在南北兩個(gè)半球地理位置相距遙遠(yuǎn)的兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)、獨(dú)立地創(chuàng)立了這項(xiàng)技術(shù)。一個(gè)研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人是當(dāng)時(shí)正在當(dāng)?shù)豈argaret 女王醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)研究所攻讀博士學(xué)位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一個(gè)研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物系的學(xué)者Ce

7、cil C. Czerkinsky （CzerkinskyCC et. al., 1983a）。,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）,,近二十多年來(lái)，隨著抗體制備、PVDF膜材料等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)是當(dāng)世公認(rèn)的最靈敏的抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況，靈敏度高。其技術(shù)原理，可一句話概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯

8、色方式將其表現(xiàn)出來(lái)（Sedgwick JD 2005）。,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）,,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）,,,,,,由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū),結(jié)核桿菌特異抗原,,ESAT-6與CFP 10抗原,采用γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)原理，依靠結(jié)核特異 抗原保證效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的特異性結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的特性，提高檢測(cè)

9、靈敏度,,三、試劑及檢測(cè)過(guò)程,,試劑盒主要原材料研究,,試劑盒主要組成成分結(jié)核桿菌特異抗原（ESAT-6、CFP 10）植物血凝素（PHA）對(duì)照抗原預(yù)包被的培養(yǎng)板、標(biāo)記二抗、底物顯色液,,國(guó)外上市情況2004年-英國(guó)MHRA認(rèn)證和歐盟CE認(rèn)證（EU）2005年-加拿大上市許可2006年-韓國(guó)上市許可2008年-美國(guó)FDA的PMA認(rèn)證2010年-中國(guó)、新加坡和俄羅斯的產(chǎn)品注冊(cè),試劑盒國(guó)外上市及應(yīng)用情況,,采集樣本（

10、外周抗凝全血）密度梯度離心分離外周血 單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）洗滌PBMCs,檢測(cè)過(guò)程,,把PBMCs與結(jié)核特 異抗原一同加入到 預(yù)包被抗γ-干擾素 抗體的培養(yǎng)孔中37℃二氧化碳孵育16-20小時(shí),檢測(cè)過(guò)程,,洗滌培養(yǎng)孔加標(biāo)記二抗孵育1小時(shí),檢測(cè)過(guò)程,,洗滌培養(yǎng)孔加顯色液用蒸餾水終止反應(yīng),檢測(cè)過(guò)程,,1個(gè)斑點(diǎn)=1個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞,檢測(cè)過(guò)程,,陰性結(jié)果,陽(yáng)性結(jié)果,空

11、白對(duì)照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10陽(yáng)性對(duì)照（PHA）,,,,,,,,,,,實(shí)際效果圖,,四、比較,,結(jié)核病的常規(guī)診斷方法,（1）細(xì)菌學(xué)檢查 是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但涂片陽(yáng)性率低，培養(yǎng)又耗費(fèi)時(shí)日（2）分子生物學(xué)檢查 雖然快速、靈敏，但操作煩瑣、技術(shù)要求高（3）結(jié)核抗體診斷 診斷價(jià)值有限，但其簡(jiǎn)便、快速，可以作為結(jié)核病的輔助診斷方 法之一（4）PPD（TST）

12、實(shí)驗(yàn) 傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測(cè)方法，對(duì)于接種過(guò)卡介苗(BCG)或環(huán)境分枝 桿菌感染的受試者會(huì)出現(xiàn)一定的假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)于使用激素或免 疫抑制劑的受試者會(huì)出現(xiàn)一定的假陰性結(jié)果,,1、方法學(xué)比較——細(xì)菌學(xué),細(xì)菌學(xué)檢測(cè)——涂片、培養(yǎng)結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”涂片：快速，簡(jiǎn)便，特異性較好，靈敏度差培養(yǎng)：耗時(shí)長(zhǎng)，特異性高，靈敏度稍高于涂片 ——美國(guó)FDA臨床數(shù)據(jù)——國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)——國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),,2、結(jié)核菌素皮試—

13、—PPD,PPD的臨床意義——陰性結(jié)果：1、表示未受結(jié)核菌感染2、某些情況下不排除已受結(jié)核菌感染, 使用免疫抑制劑等;免疫功能低下如重癥結(jié)核病,慢性消耗性疾病,腫瘤,艾滋病,高齡等。3、陰性也不表示沒(méi)有結(jié)核感染.值得注意的是假陰性情況,在臨床上有感染結(jié)核的確切依據(jù)而患者PPD試驗(yàn)卻陰性,這種情況常見于以下疾?。撼醮胃腥窘Y(jié)核菌4～8周以內(nèi),重度營(yíng)養(yǎng)不良,惡性腫瘤,機(jī)體免疫缺陷性疾?。ㄏ忍煨悦庖呷毕莅Y,艾滋病）,免疫抑制劑使用者等,個(gè)

14、別老年人因機(jī)體變態(tài)反應(yīng)功能低下也常呈陰性反應(yīng)。,,結(jié)核菌素皮試——PPD,PPD的臨床意義——陽(yáng)性結(jié)果：1.一般陽(yáng)性和中度陽(yáng)性：結(jié)核病現(xiàn)癥患者；已受結(jié)核菌感染但并不意味著發(fā)病或患??；卡介苗接種所致變態(tài)反應(yīng)；2.強(qiáng)陽(yáng)性：結(jié)核病患者；感染結(jié)核菌未發(fā)病者.強(qiáng)陽(yáng)性人群結(jié)核病的發(fā)病率高,在未找到病變時(shí)可作預(yù)防性治療。,,T-SPOT.TB 與皮試的比較,皮試TST(PPD)的影響因素1、免疫力狀況——年齡、藥物2、交叉反應(yīng)—

15、—卡介苗、環(huán)境分枝桿菌3、檢測(cè)操作、結(jié)果判斷,,方法學(xué)比較——TST Vs T-SPOT.TB,假陽(yáng)性—卡介苗接種—環(huán)境分枝桿菌假陰性—免疫力狀況—年齡（新生兒、老年人）—藥物,,特異性—不受卡介苗接種影響—不受環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度—基本不受免疫力狀況影響—肺外結(jié)核檢出率高—藥物、年齡,例：研究數(shù)據(jù),293例懷疑結(jié)核病的非洲兒童平均年齡3歲，約46% HIV抗體陽(yáng)性，多數(shù)合并營(yíng)養(yǎng)不良57例確診結(jié)核病的

16、兒童中，ELISPOT陽(yáng)性率81%；TST陽(yáng)性率35%年齡、 HIV感染狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)不良的嚴(yán)重程度對(duì)ELISPOT結(jié)果無(wú)影響，但均能導(dǎo)致TST結(jié)果的顯著差異,,Liebeschuetz et al Lancet. 2004,方法學(xué)比較——TST Vs T-SPOT.TB,,,五、臨床及評(píng)價(jià),,1、將該產(chǎn)品（方法學(xué)IGRA）寫入診療指南的國(guó)家（Guidelines）,英國(guó)、愛爾蘭、德國(guó)、法國(guó)、意大利、瑞士、荷蘭、葡萄牙、丹麥、挪威

17、美國(guó)、加拿大日本、韓國(guó)、澳大利亞等,,,,指南解讀（一）,建議用IGRA替代TST用于結(jié)核篩查德國(guó)、英國(guó)、瑞士、丹麥、波蘭等適用于抗TNF-α 治療人群,,指南解讀（二）,TST和IGRA兩者均可美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞、日本等卡介苗(BCG)接種人群首選IGRA（美國(guó)）,,指南解讀（三）,兩步法：先用TST，再用IGRA以提高靈敏度與特異性加拿大、西班牙、荷蘭、韓國(guó)、澳大利亞等主要適用于接觸追蹤,,2、應(yīng)用方向,

18、1）結(jié)核病輔助診斷/療效評(píng)價(jià)“菌陰”結(jié)核病患者的輔助診斷肺外結(jié)核的鑒別診斷抗癆治療的療效評(píng)價(jià)2）免疫力低下/受抑制患者的結(jié)核診斷/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者的結(jié)核感染篩查HIV感染者/腎透析患者/器官移植患者3）兒童結(jié)核病的輔助診斷4）結(jié)核密切接觸者/高危人群的結(jié)核感染篩查結(jié)核病患者的家屬/醫(yī)務(wù)工作者/監(jiān)獄囚犯5）接觸追蹤,,對(duì)于“涂陰”結(jié)核病患者有很高的檢出率（94.2%）對(duì)于肺外結(jié)核病患者有很高的檢出

19、率（90.3%）對(duì)于結(jié)核潛伏感染的檢測(cè)，不受卡介苗（BCG）接種影響，比PPD檢測(cè)更準(zhǔn)確 不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來(lái)判斷受試者是活動(dòng)性結(jié)核病患者或是潛伏感染者對(duì)于結(jié)核/癌癥患者的鑒別診斷，須結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行判斷,科室特點(diǎn),消化科——腹水待查——腸結(jié)核的鑒別診斷——發(fā)熱待查——生物制劑治療前結(jié)核篩查,,科室特點(diǎn),呼吸/傳染/感染科——呼吸系統(tǒng)疾病與結(jié)核鑒別診斷——胸水/心包積液鑒別診斷

20、——肺外結(jié)核輔助診斷——發(fā)熱待查,,科室特點(diǎn),風(fēng)濕免疫科——生物制劑/免疫抑制/激素等藥物的使用——結(jié)核篩查——肺結(jié)核與肺間質(zhì)病的鑒別診斷——發(fā)熱待查,,科室特點(diǎn),兒科——兒童肺結(jié)核的輔助診斷——兒童肺外結(jié)核的鑒別診斷,,評(píng) 價(jià),特異性好，不受卡介苗（BCG）接種與環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度高，受個(gè)體免疫功能低下影響小快速，24小時(shí)報(bào)告結(jié)果,,評(píng) 價(jià),不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來(lái)判斷