二苯醚及低溴代二苯醚好氧降解菌篩選及降解機(jī)制研究.pdf

1、多溴二苯醚作為阻燃劑，長期用于電器、玩具、服裝等眾多涉及到生產(chǎn)和生活的領(lǐng)域。該化合物與塑料本身不存在任何化學(xué)鍵的結(jié)合，隨時(shí)間可從塑料制品中流失，進(jìn)入周圍環(huán)境。這類化合物的可降解性極差，在土壤中半衰期可達(dá)20年，一旦進(jìn)入環(huán)境，便處于長期存留狀態(tài)而日積月累。由于其具有親脂性，一旦進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，容易在組織中積累，并可通過食物鏈的傳遞而逐步富集。
　　多年的研究表明，多溴二苯醚可以對動(dòng)物產(chǎn)生毒性，其作用包括影響正常的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、干擾內(nèi)分

2、泌系統(tǒng)，甚至有可能具有潛在的致癌性。
　　生物降解多溴二苯醚相較于采用其他理化方法，可操作更高，更容易應(yīng)對土壤等自然環(huán)境的需要。其中，厭氧細(xì)菌修復(fù)可以有針對性地使取代溴從苯環(huán)骨架上脫落;而好氧細(xì)菌則有能力降解取代溴較少的二苯醚，使其分解為更小的分子結(jié)構(gòu)?？紤]到好氧細(xì)菌更易于應(yīng)對環(huán)境原位修復(fù)，本研究將研究側(cè)重點(diǎn)放在好氧的二苯醚以及低溴代二苯醚降解細(xì)菌的發(fā)掘之上。在本文中，還對發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌降解二苯醚及低溴代二苯醚的機(jī)制進(jìn)行了詳盡的解析，

3、以期為進(jìn)一步闡明該菌株的降解性能做好理論上的準(zhǔn)備。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1)二苯醚降解菌的篩選及其降解性能分析
　　采用二苯醚作為篩選底物，以可利用二苯醚作為碳源生長作為篩選指標(biāo)，從杭州一處污水處理廠的活性污泥中獲得可以二苯醚為碳源穩(wěn)定存在并將其降解的混合細(xì)菌富集物。從該富集物中，分離得一株可利用二苯醚為碳源生長的革蘭氏陰性菌，鑒定后命名為Cupriavidus basilensis WS。該菌株在6天內(nèi)可以將1g/

4、L的二苯醚完全降解，轉(zhuǎn)化為自身的菌體，在整個(gè)過程中無任何中間產(chǎn)物檢出。該菌株也可降解4-溴二苯醚以及4，4'-二溴二苯醚，在降解4-溴二苯醚的過程中，檢測到中間產(chǎn)物苯酚。
　　2)基于C.basilensis WS隨機(jī)突變定位降解基因
　　以mini-Tn5轉(zhuǎn)座子作為工具，隨機(jī)于基因組上打斷Cupriavidus sp.WS的基因，構(gòu)建了包含數(shù)千個(gè)菌株的突變庫。對該突變庫進(jìn)行篩選后，獲得了6株確定已經(jīng)喪失二苯醚降解能力的菌株

5、。通過染色體步移確定了這6個(gè)突變株被轉(zhuǎn)座子打斷的基因后，發(fā)現(xiàn)所有被打斷的基因都位于bph基因簇，所編碼蛋白都與聯(lián)苯-2，3-雙加氧酶相關(guān)。
　　3)各bph基因在二苯醚降解中功能及降解途徑的確定
　　在將二苯醚降解能力與bph基因簇關(guān)聯(lián)后，我們采用E.coli作為外源表達(dá)的平臺，將多個(gè)候選的bph基因重新組合，一步步還原出了二苯醚的降解過程。在此期間，對每一次反應(yīng)生成的產(chǎn)物作了詳細(xì)的鑒定。結(jié)果表明，BphA(BphA1+Bp

6、hA2+BphA3+BphA4)、BphB、BphC依次完成了二苯醚降解的1-3步，直至生成苯酚和PCA。結(jié)合前期對C.basilensis WS降解產(chǎn)物的分析，我們認(rèn)為該菌株有能力礦化二苯醚。
　　4)基于天然質(zhì)粒pWS的C.basilensis/E.coli穿梭載體構(gòu)建及應(yīng)用
　　從C.basilensis WS中分離得到天然質(zhì)粒pWS并測定其序列后，我們對pWS的序列進(jìn)行多次分割并構(gòu)建為不同的載體，確定了pWS所需的最

7、小復(fù)制子。該復(fù)制子中，除了rep基因的編碼區(qū)不可替代，其他原件包括rep的啟動(dòng)子均可以剔除或替換。以最小復(fù)制子為核心，我們構(gòu)建了C.basilensis/E.coli穿梭載體pCB5。有趣的是，通過調(diào)節(jié)pCB5中Rep的供應(yīng)量，我們將該載體在C.basilensisWS中的拷貝數(shù)從1-3提高到16。在pCB5的基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了pBP-lacZ和pDMP-lacZ兩個(gè)報(bào)告載體，并以此分析了bph、dmp基因簇在二苯醚降解過程中的轉(zhuǎn)錄情況