浙大生化實驗一

1、1實驗報告課程名稱：生物化學實驗（甲）指導老師：成績：__________________實驗名稱：蔗糖酶的提取及離子交換柱層析分離純化蔗糖酶實驗類型：生化實驗同組學生姓名：一、實驗目的和要求（必填）二、實驗內容和原理（必填）三、實驗材料與試劑（必填）四、實驗器材與儀器（必填）五、操作方法和實驗步驟（必填）六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理七、實驗結果與分析（必填）八、討論、心得一、實驗目的和要求一、實驗目的和要求1、學習掌握蔗糖酶的提取、分離純化

2、的基本原理和方法。2、學習離子交換層析的基本原理；3、學習離子交換層析分離蛋白質的基本方法和技術；4、學習蔗糖酶活性檢測的基本原理和方法。二、實驗內容和原理二、實驗內容和原理1、酵母細胞破碎本實驗采用研磨的方法。通過固體剪切法（研磨）將酵母細胞破碎，把蔗糖酶從酵母細胞中提取出來。2、蔗糖酶的初步分離純化蛋白酶常用的初步分離純化方法有：鹽析、選擇性變性、有機溶劑沉淀等。本實驗采用選擇性變性（加熱）、有機溶劑（乙醇）沉淀等方法對蔗糖酶進行初

3、步的提純。由于酶蛋白在分離純化過程中易變性失活，為了能獲得盡可能高的產率和純度，在提純操作中要始終保持酶的活性，如在低溫下操作等，這樣才能收到較好地分離提純效果。3、離子交換層析離子交換層析是常用的層析方法之一。它是以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換劑與流動相中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或者借助離子交換劑上電荷基團對溶液中

4、離子或離子化合物的吸附作用進行。在某一pH值的專業(yè)：生物科學姓名：學號：日期：地點：裝訂線34、托盤天平（離心管平衡用）；5、高速冷凍離心機；6、恒溫水浴箱；7、制冰機；8、1.5ml離心管；9、－20℃冰箱；10、層析柱（φ1.020㎝）(1支組）；11、恒流泵（流速0.8～1mlmin）(10rpm)（1臺組）；12、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套組）；13、核酸蛋白檢測儀（靈敏度0.5A）（1臺組）；14、記錄儀（紙速：0.

5、5mmmin；靈敏度：50mV）（1臺組）；15、部分收集器及收集試管（1臺組）；16、鐵架臺、夾子（固定層析柱用）（1套組）；17、－20℃冰箱；18、試管、試管架等。五、操作方法和實驗步驟五、操作方法和實驗步驟1、酵母細胞破碎稱取市售干酵母粉10g，約35g石英砂放入研缽中直接干燥充分研磨至盡可能成細粉末狀（約15分鐘），量取總體積3040ml的20mmolLTrisHClpH7.3緩沖液，分2次加在研砵內研磨10分鐘，使呈糊狀液體

6、（研磨越徹底，釋放出的蔗糖酶越多）；將糊狀液體轉移到2支50ml離心管中，兩支離心管平衡后，4℃、12000rmin離心15分鐘（這次離心分離掉酵母碎片和酵母），收集上清液并量出體積V1（樣品I）另留1ml上清液（樣品I）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量測定、蔗糖酶活力測定和SDSPAGE分析。2、熱處理：將上一步抽提液（樣品I），迅速放入50℃恒溫水浴中，保溫30分鐘，并用玻璃棒溫和攪拌抽提液（由于蔗糖酶相對耐熱，熱處理能除去