免疫共沉淀原理及實驗方法

1、注冊┆登錄┆發(fā)表文章?免疫共沉淀原理及實驗方法免疫共沉淀原理及實驗方法2007032216:07:46大中小免疫共沉淀免疫共沉淀一原理：原理：IPIP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“preinpreinA“A“特異特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的性地結(jié)合到免疫球蛋白的FCFC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prein

2、preinA預(yù)先結(jié)合固化在預(yù)先結(jié)合固化在argaroseargarose的beadsbeads上，使之與含有抗原的溶液及抗上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，體反應(yīng)后，beadsbeads上的上的preinpreinA就能吸附抗原達到精制的目的。就能吸附抗原達到精制的目的。實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)。抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在結(jié)合未必能用在

3、IPIP反應(yīng)。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是反應(yīng)。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。問題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細胞構(gòu)成的蛋白，特別其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。

4、另一面，如用弱界面活性劑沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IPIP成功，也是很多蛋白與抗成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。體共沉的悲慘結(jié)果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗

5、原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體每次實驗之前，首先考慮抗體緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在則就不能沉降在beadsbeads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。欲速則不達，確定好比

6、例很必要?？乖幌♂尅Ｓ賱t不達，確定好比例很必要。(待續(xù)待續(xù))二準備：準備：器械器械#微量高速冷凍離心機微量高速冷凍離心機#移液槍移液槍#旋轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)盤#電泳設(shè)備電泳設(shè)備#vtex#vtex震蕩器震蕩器#液氮及組織粉碎器液氮及組織粉碎器1調(diào)制調(diào)制proteinproteinAsapharosesapharoseproteinproteinAsapharosesapharose5ml5ml溶于溶于20ml20ml含0.02%NaN30.0

7、2%NaN3的PBSPBS離心離心20002000轉(zhuǎn)2分，去上清，在沉淀加分，去上清，在沉淀加0.02%NaN30.02%NaN3的PBSPBS，離心后去上清，重復，離心后去上清，重復2次，最后沉淀加次，最后沉淀加20ml20ml含0.02%NaN30.02%NaN3的PBSPBS，冷藏保存，冷藏保存用單抗做一抗時，把用單抗做一抗時，把proteinproteinAsapharosesapharose先用抗鼠先用抗鼠IgIg兔血清處理兔

8、血清處理(每50ulprotein50ulproteinAsapharosesapharose用15ul15ul血清血清)。旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)12h12h混勻后，再離心混勻后，再離心12s12s去上清后，加去上清后，加PBSPBS，vtexvtex混合，離心去上清，重復二次混合，離心去上清，重復二次加含加含0.02%NaN30.02%NaN3的PBSPBS到原來體積，冷存。避免長期保存。到原來體積，冷存。避免長期保存。2抗原的檢出抗原的檢出以下

9、操作全在冰面或以下操作全在冰面或4度進行度進行去除細胞培養(yǎng)液，用冷去除細胞培養(yǎng)液，用冷PBSPBS洗一次。加洗一次。加RIPARIPA，溶解后，轉(zhuǎn)移到，溶解后，轉(zhuǎn)移到eppentubeeppentube中用中用vtexvtex混勻?；靹?。RIPARIPA的量：的量：6cm6cm的培養(yǎng)皿加的培養(yǎng)皿加1ml(ml(蛋白質(zhì)的量為蛋白質(zhì)的量為500mgml)500mgml)組織組織塊用液氮粉碎，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量。塊用液氮粉碎，在緩沖劑中

10、搗勻，蛋白定量。30m30m，15000rpm15000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新離心，上清轉(zhuǎn)移到新tubetube。不用移液槍，直接從。不用移液槍，直接從tubetube倒進另倒進另一個一個tubetube往上清加抗體，往上清加抗體，1ml1ml加25ul25ul抗體，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻抗體，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1h1h加proteinproteinAsapharose50ulsapharose50ul，再混勻，再混勻1h1h5000rpm500

11、0rpm離心離心1s1s使sapharosesapharose沉淀，去上清。往沉淀，去上清。往sapharosesapharose加RIPARIPA，vtexvtex混勻，離心，去上清。重復混勻，離心，去上清。重復4次洗凈。次洗凈。加電泳用加電泳用samplesample緩沖液緩沖液40ul2m40ul2m煮沸，泳動后，固定煮沸，泳動后，固定干燥膠，現(xiàn)像。干燥膠，現(xiàn)像。3.3.注意點注意點A：不熟練使用移液槍，會混入沉淀的不溶性蛋白，使

12、實驗失敗。對無論怎么也：不熟練使用移液槍，會混入沉淀的不溶性蛋白，使實驗失敗。對無論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機。除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機。B：對電泳的非特異條帶，最后可依次用含：對電泳的非特異條帶，最后可依次用含300mM300mM，1omMNaCl1omMNaCl的RIPARIPA洗凈各一洗凈各一次。次。(完)評論()引用閱讀(876)圈子打印有獎舉報免疫共沉淀原理及實驗方法